骨桥蛋白对大鼠发生草酸钙肾脏结石的影响

赵 明 易 虎

(天津中医药大学第一附属医院泌尿外科，天津 300193)

草酸钙结石是泌尿系结石的主要类型，占泌尿系结石的60%～80%〔1〕。在肾结石的形成过程中，肾上皮细胞(NRK)具有十分重要的作用〔2〕。研究显示〔3〕，体外钙刺激大鼠NRK细胞可诱导细胞骨桥蛋白(OPN)基因表达上调，OPN分泌增加。OPN可能参与了肾结石的形成过程，但其确切机制尚不清楚，且极少有体内实验报道。本研究通过小干扰RNA技术(siRNA)沉默OPN基因的表达，分析OPN在肾结石大鼠中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及细胞 雄性SD大鼠30只，体重160～180 g(天津实验动物中心提供)；293T细胞(上海复祥生物科技有限公司)。

1.2主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，美国sigma公司)；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液5×(碧云天生物技术研究所)；腺病毒骨架质粒pAdeno-X(Clontech公司)；辣根酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(Jakson分装)；内参抗体β-actin(北京康为世纪生物科技有限公司)；Western 一抗、二抗稀释液(碧云天生物技术研究所)；DAB 染色试剂盒(北京康为生物科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；其他试剂均为分析纯国产试剂。

1.3主要仪器 超净工作台(AIRTECH，苏州净化设备有限公司)；紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)；BS223S型电子天平(北京赛多利斯仪器系列有限公司)；台式低温高速冷冻离心机(太仓市医疗械厂)；定量 PCR 仪(ABI step one plus，美国)；多功能酶标仪(DG-3022，美国)；GeneChip®Scanner (Affymetrix，美国)；NanoDrop超微量分光光度仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；电泳仪(GE，美国)。

1.4方法

1.4.1重组RNA干扰腺病毒表达载体的构建与包装 参照文献〔4〕方法，利用OligoEngine RNAi设计软件，设计出针对OPN siRNA的特异性靶序列，siOPN上游引物5′-CGGTGAAAGTGGCTGAGTTT-3′，siOPN下游引物5′-TTTTCCCTTAGCCTTTATAGCAC-3′。siOPN上、下游引物重组入pSIREN-Shuttle，得到pSIREN-Shuttle-siOPN，经酶切得到siRNA单元siOPN，分别重组入腺病毒载体pAdeno-X，得到pAdeno-X-siOPN，DNA测序证实。Pac I酶切重组腺病毒质粒pAdeno-X-siOPN，用Lipofectamine2000将线性化的pAdeno-X-siOPN转染至293T细胞，培养，收获、纯化重组病毒，测定滴度。

1.4.2高草酸尿大鼠模型的建立及分组 30只SD大鼠分为对照组、OPN siRNA组和空载组，每组10只。对照组用单蒸水和标准颗粒饲料适应性喂养，OPN siRNA组和空载组喂饲含1%氯化铵和0.8%乙二醇的饮水(加标准颗粒饲料)，喂饲9 d。

1.4.3腺病毒表达载体导入大鼠肾脏 建立模型后，饲养6 w，全身麻醉(腹腔注射10%水合氯醛)，连接动物呼吸机，气管切开，打开胸腔，暴露肾脏，游离出左肾静脉，使用小儿头皮针穿刺肾静脉。OPN siRNA组大鼠肾脏注射rAAV-asOPN 100μl(约6×107IU)，空载组注射等量空载体病毒颗粒。对照组不做处理。术毕，关闭胸腔，撤除呼吸机。清洁级环境、普通饲料饲养6 w后观察各实验指标。

1.5观察指标

1.5.1RT-PCR检测OPN基因转录 取出各组大鼠肾脏，Trizol法分别提取各组大鼠总RNA，目的基因引物序列：GADPH(305 bp)上游引物：5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，下游引物：5′-GGTGGTGAAGAC GCCAGTAG-3′；OPN(245 bp)上游引物：5′-GGCACATTCCGGGACAGAGAGAA-3′，下游引物5′-CGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3′。 逆转录为cDNA，应用RT-PCR检测OPN mRNA转录水平，以GADPH作为内参照。

1.5.2Western印迹检测OPN蛋白表达 取出各组大鼠肾脏，剪刀切碎，用预冷的组织裂解液提取大鼠肾脏总蛋白，Bradford法测定样品的蛋白含量，12%凝胶分离蛋白质，利用转膜仪(湿转)在100 V、1.5 h的条件下将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后与OPN单克隆抗体(1∶1 000)过夜结合，ECL显色，凝胶成像和化学发光分析系统收集显色条带，运用Quantity One软件进行蛋白条带数据分析。

1.5.3HE染色观察草酸钙晶体 参照文献〔5〕方法，取肾后用预冷的PBS-草酸钙溶液清洗肾脏组织，切肾组织成厚2～3 mm的小块，再用预冷的PBS-草酸钙溶液清洗。室温下10%甲醛固定24 h。结束后，用预冷的PBS-草酸钙溶液清洗清洗3次，置入20%蔗糖溶液，4℃脱水72 h。再置入20%明胶，室温下过夜，-80℃保存，制作10 μm冰冻切片。显微镜下观察草酸钙结晶形成情况。随机选取6个视野，结晶程度计数用像素值(像素/视野)表示。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1OPN mRNA表达水平 OPN siRNA组OPN mRNA表达水平(0.25±0.08)显著低于空载组(0.95±0.12，P<0.05)，显著高于对照组(0.05±0.02，P<0.05)。

2.2OPN蛋白表达水平 OPN siRNA组OPN 蛋白表达水平(0.33±0.09)显著低于空载组(0.96±0.15，P<0.05)，显著高于对照组(0.08±0.02，P<0.05)。

2.3草酸钙结石结石情况 OPN siRNA组大鼠肾皮质和肾髓质草酸钙结石均显著低于空载组(P<0.05)，显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肾皮质和肾髓质草酸钙结石情况

与空载组比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05

3 讨 论

我国泌尿系结石发病率为1%～10%，且呈逐年上升趋势〔6〕。肾结石的常见成分为草酸钙结石〔1〕。

OPN是一种多功能磷酸化糖蛋白，在骨骼、乳腺、肾脏、NK细胞及T 细胞等广泛分布，具有多种功能。目前，OPN在结石形成过程中的作用还存在争议。有学者认为OPN具有抑制草酸钙结晶形成的作用；也有研究发现，在结石形成早期阶段OPN可能促进RNK细胞与草酸钙结晶体的结合过程〔7〕。本文结果表明OPN siRNA病毒能有效抑制肾组织OPN的表达水平。

在细胞水平已有大量研究证明了OPN在草酸钙结晶形成过程中的重要作用。席启林等〔4〕采用钙离子干预大鼠肾上皮细胞，结果显示钙离子刺激后NRKOPN表达水平上升，通过构建有效沉默OPN基因表达的慢病毒载体并导入大鼠NRK细胞，可显著降低OPN表达水平和一水草酸钙含量。欧善际〔8〕报道，大鼠肾小管上皮细胞受一水草酸钙刺激后OPN 表达水平上升，但高浓度一水草酸钙使OPN表达水平降低，认为高浓度一水草酸钙通过损伤肾小管上皮细胞导致OPN表达水平降低，进而促进形成结石。Yamate等〔9〕也证实在肾结石形成的早期阶段，OPN具有促进草酸钙结晶在细胞上沉积和黏附的作用，通过沉默OPN可抑制草酸钙晶体的沉积。因此，结石形成早期阶段，OPN可能促进了NRK与草酸钙结晶体的结合过程。

本研究表明，抑制大鼠肾组织OPN表达可降低草酸钙晶体在肾皮质和髓质的沉积，OPN具有促进草酸钙肾结石形成的作用，与文献报道一致〔6〕。目前多数研究认为由集合管、远曲小管和髓袢等分泌的OPN可抑制尿路结石形成，主要表现在抑制草酸钙结晶的黏附力和成核；同时，尿液中的OPN可促进一水草酸钙向黏附力较低的二水草酸钙转化，促进二水草酸钙的排泄〔10〕。

1Mohamaden W，Wang H，Guan H，etal.Immunohistochemical localization and mRNA quantification of osteopontin and Tamm-Horsfall protein in canine renal tissue after potassium oxalate injection〔J〕.BMC Vet Res，2014；10(1)：70.

2王 立，李 磊，李 博.雌二醇对草酸钙结石造模大鼠肾小管细胞骨桥蛋白表达的影响〔J〕.中国医药导刊，2012；14(s2)：619-20.

3姚秀琼，邓穗平，欧阳健明.HKC细胞损伤对草酸钙晶体成核和聚集的促进作用〔J〕.高等学校化学学报，2011；32(2)：236-40.

4席启林，刘 喆，侯建全，等.骨桥蛋白在高钙促进大鼠肾上皮细胞与草酸钙晶体黏附中的作用〔J〕.中华实验外科杂志，2014；31(8)：1762-5.

5马 超，席启林，侯建全，等.沉默高草酸尿大鼠肾脏骨桥蛋白基因的表达对草酸钙晶体在肾脏中沉积的影响〔J〕.中华实验外科杂志，2016；33(12)：2675-7.

6徐 刚，夏 维，邹晓峰，等.肾特发性草酸钙结石形成与骨桥蛋白的关系〔J〕.中华实验外科杂志，2015；32(6)：1252-5.

7甘琼枝，孙新园，姚秀琼，等.肾上皮细胞损伤使草酸钙晶体黏附增强的分子机制〔J〕.高等学校化学学报，2016；37(6)：1050-8.

8欧善际.草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞骨桥蛋白表达的影响〔D〕.长春：吉林大学，2011.

9Yamate T，Kohri K，Umekawa T，etal.Osteopontin antisense oligonucleotide inhibits adhesion of calcium oxalate crystals in Madin-Darby canine kidney cell〔J〕.J Urol，1998；160(4)：1506-12.

10夏 维.骨桥蛋白与特发性草酸钙结石的相关性研究〔D〕.南昌：南昌大学，2014.