西藏小型猪和五指山小型猪的生理特点及其动脉粥样硬化的发病特征比较研究

陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所, 杭州 310053)

1 背景

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病和脑卒中发生的主要病因。高血脂、高血糖、肥胖、高血压和高胰岛素血症等胰岛素抵抗引起的代谢综合征的各种临床表象均为AS的重要危险因素[1,2]。人类AS的发病模式多种多样，在高血脂环境下，有肥胖导致胰岛素抵抗、共同促进AS形成，也有胰岛素抵抗导致高血压、加速AS形成，往往同时存在代谢综合的一种或多种临床表象，其发生与发展是多因素、多步骤的，是遗传因素和环境因素相互作用的结果[3,4]。流行病学和遗传学研究表明，AS的形成与生物学因素如肥胖、血压、血糖升高、血脂异常等[5]，心理因素包括个性特征(A型或D型人格)[6]和情绪异常(焦虑、抑郁)等[7]、以及家族史等[8]有很大的关系。因此, 研究和建立多基因、多靶点、多层次的动物模型对疾病的病理机制和治疗药物研究具有非常重要意义。

猪在循环系统、血小板凝聚系统、脂蛋白代谢及消化系统均与人类极为相似，其AS病变可见于腹主动脉和冠状动脉大分支，与人类AS病变的分布特点相一致，病理学检测亦表明，猪AS斑块具有人类成熟斑块的特点，且小型猪过度紧张或兴奋等刺激会促发AS、心肌梗死等心血管疾病[9,10]，已成为研究心血管疾病的病理机制和治疗药物疗效研究的一个重要模型。国外有一些特殊品系，如Yucatan、Göttingen、Ossabaw小型猪等，在高脂饲养环境下，除出现高脂血症外，可自发肥胖、糖尿病、高血压和AS等，具有独特的应用特点和价值，广泛应用于心血管疾病的研究[11-13]。我国小型猪种质资源丰富，如常用的巴马小型猪、五指山小型猪、贵州香猪、中国农大小型猪、西藏小型猪等等，但由于缺乏对其生物学功能和医学用途的研究，各品系在心血管疾病研究的应用生理特点均不清楚，使用时缺少选择性和针对性。在AS研究中，较早且常用的巴马小型猪, 用高脂环境诱导AS的形成往往造模周期过长, 除老年猪外，一般需9～12个月以上。因此，许多研究者[14,15]采用球囊损伤血管加高脂饲喂或缩管环手术致冠脉狭窄或药物诱导加高脂饲喂致AS形成，以求缩短造模时间，但这些手术诱发因素与临床AS的发生和病因存在一定的差异，且这些诱导方法均未考虑冠心病的遗传异质性和心理因素。为此，研究者[16]一方面通过提高饲料中的脂肪含量，同时添加动物油和植物油，改善饲料的适口性，研制合适的高脂饲料配方，在不同的小型猪品系上进行尝试，另一方面进行生理和遗传学特性的研究，以寻找在高脂饲养环境下能自发心血管疾病或有遗传易感性的品系。我们前期研究表明[17,18]，五指山小型猪和西藏小型猪在高脂环境下易形成AS，且同时并存如肥胖、高血脂、高血压、胰岛素抵抗等多种AS危险因素，本文将我们的研究工作作一回顾，为在心血管疾病领域研究中的选择和应用提供参考。

2 生理特点

前期研究在对五指山小型猪和西藏小型猪生活习性观察中显示[19], 五指山小型猪胆小, 易激动, 性格暴躁、易攻击实验者, 常表现出恐惧、敌意的姿势, 对应激敏感。在长途运输后, 应激反应明显。而西藏小型猪则性情温顺, 对环境适应能力较强, 不易应激, 在长途运输后, 应激反应相对较小, 且易恢复, 对实验者也无攻击性。在高脂环境下, 五指山小型猪和西藏小型猪均易形成AS, 且并存多种AS形成的危险因素, 但其发病症状和临床表现各有特点。

2.1 运输应激

运输应激可释放皮质醇、抑制抗体反应和细胞吞噬功能, 从而导致机体免疫抑制, 而皮质醇是应激的终产物[20]。我们[19]研究表明，五指山小型猪和西藏小型猪在运输超过4 h后均出现明显的机体应激反应，表现为在运输应激后皮质醇(CORT) 和促肾上腺皮质激素(ACTH)明显升高，且五指山小型猪的变化幅度相对较大。在恢复饲养14 d起明显降低，至28～42 d时处于稳态。运输后五指山小型猪和西藏小型猪的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)指标均显著升高。同时, 白细胞(WBC)、中性粒细胞百分比(%NEUT)和中性粒细胞/淋巴细胞(N/L)比值增加，淋巴细胞百分比(%LYM)减少。长途运输后，小型猪的血气电解质也发生变化，且五指山小型猪运输应激后血气电解质的变化幅度较为明显，在适应恢复35～42 d时pH和HCO3-仍明显降低。西藏小型猪需经过适应恢复期28 d以上后血液生理指标变化达到稳态，而五指山小型猪对应激反应较为敏感，且需要相对较长的恢复期。

2.2 对外源性脂肪的敏感性

五指山小型猪和西藏小型猪静脉注射脂肪乳，对甘油三酯(TG)敏感，脂耐量值西藏小型猪大于五指山小型猪，而高脂饲料饲喂对总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)敏感，脂耐量值五指山小型猪大于西藏小型猪，五指山小型猪对TC和TG水平的清除相对较慢，且冠心病危险因子水平TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C 远远高于西藏小型猪[21]，可见，五指山小型猪和西藏小型猪的血脂代谢水平在脂肪乳或高脂诱导后显示出不同的变化规律。

3 AS形成的病症特点

用高脂诱导五指山小型猪和西藏小型猪均可建立高脂血症或AS模型，与其它品系的小型猪比，五指山小型猪和西藏小型猪在高脂环境下AS形成较快, 一般高脂饲喂16周时 AS开始形成, 至24周后AS的病变严重，斑块成熟，主要分布于腹主动脉和冠状动脉。且五指山小型猪和西藏小型猪在AS形成过程中，除高血脂外，同时还并存肥胖、高血压、炎症及胰岛素抵抗等多种临床症状，这与人类的临床表现极为相似。

3.1 高血脂与肥胖

在高脂饲料饲喂下，五指山小型猪血脂上升快且能保持稳定的高水平状态[22]，呈现严重的高脂血症，而同样的高脂饲料配方进行饲喂，西藏小型猪的血脂水平前期上升幅度较快而后期相对较低[23]，但西藏小型猪的动脉脂质蓄积和AS病变仍很严重，斑块成熟。在同样配方的高脂饲料和同样的环境下饲养，五指山小型猪体质量迅速增加并出现重度肥胖，体型大而圆，皮下脂肪大量沉积，而西藏小型猪虽体质量增加但外观壮而不肥，体型瘦长, 内脏脂肪沉积较多，提示五指山小型猪属外周型肥胖，而西藏小型猪属中心型内脏肥胖。

3.2 炎症反应

西藏小型猪对高脂诱导的炎症反应相对敏感，在高脂饲喂2周后出现, 表现为单核细胞(MONO)、WBC和NEUT明显上升，血清C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)明显升高，且呈持续的炎症反应，在高脂饲喂24周后，炎症程度更为严重。而五指山小型猪初期呈现出低度炎症，表现为单核细胞升高和血清CRP、IL-6，TNF-α明显上升，但其升高幅度低于西藏小型猪, 在高脂饲喂24周后五指山小型猪出现中度炎症。五指山小型猪和西藏小型猪的腹主动脉和冠状动脉血管斑块中血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋附因子 -1(MCP-1)和核因子 -κB(NF-κB) p65和血管内皮生长因子(VEGF)均大量表达, 与五指山小型猪相比，西藏小型猪血管斑块中VCAM-1、ICAM-1、MCP-1和NF-κB p65和VEGF的表达更为强烈。

3.3 高血压和胰岛素抵抗

我们课题组前期研究表明[18,23], 高脂环境下西藏小型猪可自发高血压，而五指山小型猪血压略有上升，但不及西藏小型猪，这两种小型猪在不同时间段发生糖耐量异常和高胰岛素血症，但空腹血糖均在正常范围, 且未见明显的多饮、多尿、体质量降低等糖尿病表征，这与人类的糖尿病前期即胰岛素抵抗状态类似。西藏小型猪在高脂诱导4周后即可出现高胰岛素血症、8周后糖耐量减低、12周后高血压形成。而五指山小型猪则在高脂诱导8周后出现高胰岛素抵抗指数升高, 20周后有显著性差异、24周时出现糖耐量异常。这与Yucatan、Göttingen等小型猪特性十分相似[11,12]。这些代谢综合征的临床表象提示，五指山小型猪和西藏小型猪AS的发病特点很符合人类以胰岛素抵抗为病理基础的多靶点AS发病特点[12,24]，在心血管疾病研究中具有很高的应用价值。大体解剖还显示，西藏小型猪的胰腺指数较小，而血清胰岛素水平明显高于五指山小型猪; 同时显示，五指山小型猪肝脏和皮下组织脂肪沉积较多，而西藏小型猪则在心脏、肾脏组织脂肪沉积较多，西藏小型猪可能适合于研究中心型胰岛素抵抗的心血管疾病模型，而五指山小型猪适合于研究外周胰岛素抵抗的疾病模型。

4 AS形成相关血脂和炎症易感基因

AS的发生与发展是多因素、多步骤的, 是遗传因素和环境因素共同作用的结果，不同个体在相同环境下, 其易感性存在差异。血脂异常与炎症反应在AS的发生过程中起重要作用, 西藏小型猪和五指山小型猪在AS形成相关的血脂和炎症易感基因的敏感性方面存在明显的异质性。

4.1 AS形成相关的血脂易感基因

我们的研究[25]表明，经高脂诱导24周后，五指山小型猪和西藏小型猪肝脏组织中载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、脂蛋白酯酶(LPL)、前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白AV(ApoAⅤ)和三磷酸腺苷结合盒式转运子A1(ABCA1)的基因表达均有不同程度的改变，提示这些基因在高脂诱导而导致小型猪代谢紊乱过程中起重要作用，但不同品系的小型猪对这些基因的敏感性不同，五指山小型猪的LDLR和PCSK9基因对高脂诱导非常敏感，而西藏小型猪的ApoB、LPL及ABCA1等基因对高脂诱导的敏感性极高。

4.2 AS形成相关的炎症易感基因

高脂饲喂24周后, 五指山小型猪、西藏小型猪外周血中T淋巴细胞亚群CD134 (OX40)、OX40配体(OX40L)、5脂氧合酶(5-LO)、5脂氧合酶激活蛋白(FLAP)、ICAM-1、VCAM-1和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达均有不同程度的升高, 这些基因在小型猪中的表达与人类极为相似，但不同品系的小型猪的表达程度不同, 五指山小型猪的5-LO、FLAP基因较为敏感，而西藏小型猪ICAM-1、VCAM-1和MMP-9基因的敏感性较高[25]，这些结果提示，5-LO信号通路激活可能是五指山小型猪在高脂诱导后加速白三烯形成进而促进炎症反应的主要途径，而西藏小型猪高脂诱导致炎症反应是白细胞与内皮细胞黏附及粥样斑块易于破裂方面起主导作用，适合于斑块易损的机制研究。

5 值得探讨的问题

五指山小型猪、西藏小型猪尤如2个不同类型的AS易感群体，而我们对五指山小型猪、西藏小型猪的研究仍限于特定的高脂环境下，这些研究结果可能对研究者在心血管疾病中对小型猪品系的选择和应用有一定的参考。但在人类的饮食习惯中，除高脂饮食外，还有高糖饮食、高盐饮食以及饮酒等习惯，且往往是高糖、高脂、高盐等多种结合的饮食，在这些多因素的饮食环境下，五指山小型猪、西藏小型猪可能会出现更多的心血管疾病的表现。另一方面，大量研究证实，肠道微生物在食物营养和健康中起着重要的作用[26]，肠道菌群可通过影响胃肠道激素的分泌调控代谢过程[27]，还可通过影响胆汁酸代谢而引起胆固醇的代谢紊乱进而促发AS[25,28]。目前我们仅观察研究五指山小型猪、西藏小型猪在高脂环境下的AS发病特征，但除五指山小型猪、西藏小型猪本身的遗传因素外，高脂环境可能与小型猪肠道菌群的种类结构或改变肠道菌群结构有关，这些问题都值得进一步探讨。