气相色谱法测定医用聚乳酸薄膜中三氯甲烷残留量

吕丽华　黄华　陆世银　苏志恒

近来，聚乳酸可吸收桩膜系统有望为乳牙残根、残冠修复提供新的方法。聚乳酸作为一种新型生物降解材料，其降解时间与乳牙牙根生理吸收时间较为同步且最终以ATP、H2O及CO2形式排除体外[1-3]。将聚乳酸可吸收根管桩在一定量的三氯甲烷中充分溶解并采用溶剂挥发成膜法[4]制成聚乳酸薄膜，对可吸收根管桩与根管壁间的封闭性能良好[5]，并且具有良好的生物相容性[6]。然而，三氯甲烷疑为致癌物质[7]，人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)将三氯甲烷归为第二类溶剂，溶剂残留限量为0.006%(60 ng/mg)，我国药典规定三氯甲烷允许残留限量为0.006%(60 ng/mg)[8]。为保证临床应用安全，本实验依据参考文献[8]中残留溶剂测定法，对医用聚乳酸薄膜中三氯甲烷残留量的测定方法进行研究，旨在建立灵敏度高，精密度好，测定结果可靠的分析方法。

1　材料与方法

1.1　仪器与试药

GC2010 Plus气相色谱仪、 RESTEK RTX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm， 日本岛津公司)。

医用聚乳酸可吸收根管桩(INION，芬兰)；三氯甲烷为分析纯(99.5%，广东汕头市西陇化工厂)，环己烷为色谱纯(99.9%，天津市光复精细化工研究所)。

1.2　色谱条件与系统适用性实验

1.2.1色谱条件GC2010 Plus气相色谱仪， RESTEK RTX毛细管色谱柱； 检测器：电子捕获检测器(ECD), 检测器温度: 270 ℃；柱温：85 ℃维持 3 min；分流进样方式，分流比：10∶1；进样口温度：200 ℃；载气：高纯氮气，流速：1.0 ml/min；进样量：1 μl。

1.2.2系统适用性及专属性试验

1.2.2.1对照品溶液的制备对照品贮备液：精密称取三氯甲烷20 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：精密量取对照品贮备液1 ml，置于100 ml棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀，配成2 000 ng/ml作为对照品溶液。

1.2.2.2供试品溶液的制备精密称取聚乳酸桩0.1 g，置于具塞棕色瓶中，加入三氯甲烷50 ml，密塞，静置3 h，待聚乳酸钉完全溶解后，将0.2 ml溶解液涂布在7 mm×20 mm的医用载玻片上制膜(0.40 mg/张)，分别在25 ℃、37 ℃、60 ℃恒温干燥箱中处理12、 24 h。每张薄膜加入400 μl环己烷于摇床上固定转数浸泡10 min。

1.2.2.3加标供试品溶液的制备取已知三氯甲烷含量的薄膜样品一张，置于棕色小瓶中，加入对照品溶液400 μl，于摇床上固定转数浸泡10 min。

1.2.2.4测定法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液和环己烷溶剂液各1.0 μl，在上述系统适应性的色谱条件下，供试品中三氯甲烷色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分达到基线分离，阴性无干扰，理论塔板数大于5000，各项色谱峰参数合格，色谱图见图 1。

图 1色谱图

Fig 1Chromatogram

1.3　实验方法

1.3.1精密度试验精密量取三氯甲烷浓度为1 000 ng/ml的溶液1 μl，按前述色谱条件，连续测定6 次，计算三氯甲烷的峰面积的RSD 0.9%。 结果显示，三氯甲烷峰面积的RSD(%)值小于2.0%，表明该方法精密度良好。

1.3.2线性范围的考察分别精密量取对照品溶液0.062 5、 0.125、 0.25、 0.75、 1.25、 1.75、 2.5 ml，分别置于5 ml容量瓶中，均加入环己烷稀释至刻度，摇匀，配成25、 50、 100、 300、 500、 700、 1 000、 2 000 ng/ml浓度梯度标准液。按前述色谱条件测定，以峰面积(A)为纵坐标、浓度(C)为横坐标，进行线性回归。线性方程为A=149.56C+99 978(r=0.999 9)，三氯甲烷检测浓度线性范围25～2 000 ng/ml。

1.3.3检测限与定量限试验采用逐步稀释法测得，以S/N=3时计算三氯甲烷的检测限，以S/N=10时计算三氯甲烷的定量限。结果检测限为1.50 ng/ml，折算成样品的含量为1.50 ng/mg；定量限为4.62 ng/ml，折算成样品的含量为4.62 ng/mg。

1.3.4重复性试验和回收率试验精密称取已知三氯甲烷含量的样品0.40 mg，分别置于棕色小瓶中，共3 份，分别加入400 μl的对照品液，于摇床浸泡萃取10 min，摇匀，按前述色谱条件测定及外标法计算， 三氯甲烷的平均回收率为98.35%， RSD=1.98%。结果显示，重复性和回收率的RSD(%)值均小于2.0%，回收率在95.0～105.0%范围内，说明该方法重复性和回收率良好。

1.4　供试品中三氯甲烷残留量测定

取三氯甲烷和经恒温干燥箱25 ℃、37 ℃、60℃分别处理12、 24 h的6批样品，按已知方法制备对照品溶液和供试品溶液，在前述色谱条件下测定，用外标法计算三氯甲烷的残留量。

2　结　果

经恒温干燥箱25 ℃处理12、24 h的样品中三氯甲烷的平均残留量分别为1 918 ng/mg，RSD=2.8%； 1 428 ng/mg， RSD=4.0%。 经恒温干燥箱37 ℃处理12、 24 h的样品中三氯甲烷的平均残留量分别为1 207 ng/mg，RSD=2.2%； 724 ng/mg，RSD=2.6%。经恒温干燥箱60 ℃处理12、 24 h的样品中三氯甲烷的平均残留量分别为68.37 ng/mg， RSD=3.5%； 18.30 ng/mg， RSD=2.4%。 结果见表 1。结果表明：经恒温干燥箱60 ℃处理24 h的样品中三氯甲烷的平均残留量18.30 ng/mg低于国家限量60 ng/mg，保证临床应用的安全性。

3　讨　论

本实验在溶剂选择方面考察了乙酸乙酯、石油醚、环己烷三种溶剂对三氯甲烷的溶解性，其中溶剂为环己烷时，三氯甲烷含量最高，石油醚次之， 乙酸乙酯最低，且环己烷萃取所得供试品色谱图杂质最少，基线最稳定，故综合考虑选用环己烷作为萃取溶剂。

目前,对残留溶剂测定一般选择火焰离子化检测(FID)检测器，可以得到较宽的线性范围；但对含卤族元素等电负性较强基团的残留溶剂如三氯甲烷等，为提高检测的灵敏度，可采用电子捕获检测器(ECD)检测器[9]。因此，本实验选择能获得较FID更高灵敏度的ECD检测器。

表 1聚乳酸薄膜三氯甲烷残留量测定结果

Tab 1Measurement result of trichloromethane residual amount in polylactic acid membrane

三氯甲烷保留时间(min)残留量(ng/mg)平均残留量(ng/mg)RSD(%)12h25℃2．1742．1772．17519681862192319182．824h25℃2．1752．1752．17714881374142314284．012h37℃2．1762．1732．17612311211117912072．224h37℃2．1752．1752．171　741　727　704　7242．612h60℃2．1832．1812．18468．4565．9270．7568．373．524h60℃2．1842．1842．18418．1418．8017．9518．302．4

干燥温度及时间是影响聚乳酸薄膜制作中三氯甲烷残留的两个重要因素，样品处理中考虑三氯甲烷的可挥发性，延长其挥发时间及提高温度加快三氯甲烷的挥发，而若挥发时间过长温度过高，样品脆性加大韧性降低，无临床实际应用意义[10]。故本实验选择在25、 37、 60 ℃恒温干燥箱中进行12、 24 h处理。有相关研究表明石墨烯能提高聚乳酸薄膜的热稳定性和增强其力学性[11]，因此，后续优化工艺时一方面可考虑加入相关物质以适当提高干燥温度、延长干燥时间从而进一步降低三氯甲烷的残留量；另一方面，改进工艺也可以考虑使用玉米淀粉或糖类发酵合成，通过挤出流涎成型法、吹塑成型法、熔融法等方法制成不含有毒物质的聚乳酸薄膜[12-14]。目前，已有使用纳米技术，通过“乳化-溶剂挥发法”制成聚乳酸相关产品[15]。

本实验通过方法学考察，该方法精密度良好，三氯甲烷检测浓度在25～2 000 ng/ml范围内线性关系良好，定量限为4.62 ng/ml，样品测定重复性和回收率良好，表明该方法灵敏，准确。测定结果表明，所检测样品中最低为17.95 ng/mg低于国家药典规定限度60 ng/mg，确保临床应用安全。本课题组相关研究聚乳酸薄膜满足口腔生物材料要求的生物功能性及相容性，本实验验证了样品的安全性，为进一步应用于临床提供可靠依据。

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