GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶的互作蛋白研究

宫艳超，张荟，赵伟伟

（天津渤海职业技术学院生物与环境工程系，天津300402）

蛋白质的翻译后修饰与基因转录有着密切的关系，其中，蛋白质的乙酰化与去乙酰化修饰是由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和组蛋白乙酰化酶（HAT）协同调控的。它们通过调节赖氨酸残基末端的电荷状态，改变蛋白质的结构与功能[1]。

目前，组蛋白去乙酰化酶根据其与酵母同源物被分为四种类型[2,3]。I型HDACs成员包括HDAC 1，HDAC 2，HDAC 3，HDAC 8，与酵母 Rpd3 同源，长度是350～500个氨基酸，主要位于细胞核中；II型HDACs成员包括：IIa类，HDAC 4，HDAC 5，HDAC 7和 HDAC 9；IIb 类，HDAC 6 和 HDAC 10，与酵母Hda1同源；IV型成员主要包括HDAC11，主要是酶活中心与I型、II型不同，也是Zn2+依赖型的水解酶[4]。HDAC与多种人类重大疑难疾病密切相关，包括癌症、心脏疾病、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等[5]。

本研究选择I类HDAC成员HDAC8作为研究对象，采用GST pull-down的方法寻找组蛋白去乙酰化酶的互作蛋白[6]。

1　实验部分

1.1　实验材料

实验中所用的HDAC8质粒pGEX-6p-1-hHDAC8由实验室保存，用于质粒扩增的菌株E.coli trans 5α（DH 5α）感受态细胞和用于表达蛋白的菌株BL21(DE3)感受态细胞购买于全式金生物技术有限公司，所用细胞株Hela细胞由实验室冻存。

1.2　仪器与试剂

Millipore型纯水仪（苏州赛恩斯仪器有限公司）、BS124S天平（德国 Sartorius）、YC-2层析实验冷柜（北京博医康实验仪器有限公司）、AKTA蛋白纯化仪（通用医疗生命科学上海有限公司）、Hitrap Q离子交换柱（通用医疗生命科学上海有限公司）、Superdex 200分子筛柱（通用医疗生命科学上海有限公司）、还原型谷胱甘肽（上海生工生物工程有限公司）、氯化钠（上海生工生物工程有限公司）、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司）、酵母粉（上海生工生物工程有限公司）

1.3　实验方法

1.3.1　pGEX-6p-1-hHDAC8的表达纯化

取20μL HDAC8蛋白甘油菌于5 mL含氨苄(100 mg/L LB)液体培养基中，37℃220 rpm振荡培养12 h。次日将过夜培养菌加入1 L LB液体培养基（含氨苄 100 mg/L）中，于 37℃振荡培养，4～6 h后加入0.4 mM IPTG诱导表达，继续16℃培养18 h后收取菌体。取6 L收集好的溶解在平衡液中的菌体，待其解冻，在冰浴中超声破碎40%功率，超4 s，停6 s，30 min，每隔10 min将菌液搅拌均匀，最后将超声好的菌液放到高速离心管里，18000 rpm 4℃离心40 min，保留上清，弃去沉淀。

使用GST-HDAC8平衡缓冲液平衡GST柱三次，每次一到两个柱体积，放于4℃。将高速所得的菌液上清流经GST柱三遍，用高低盐洗杂缓冲液进行交替洗杂，取20 μL的洗杂液和80 μL的G250混合，直至G250不变蓝，洗杂结束，然后用2×GSH洗脱目的蛋白。取20 μL的洗脱液和80 μL的G250混合，直至G250不变蓝，洗脱结束，用10 KD的浓缩管将GST-HDAC8蛋白浓缩到小体积，备用。

离子交换层析（Hitrap Q柱），按系统操作执行进行洗泵，结束后将泵头A、B分别放入到抽滤过的His-HDAC8离子交换低盐缓冲液和GST-HDAC8离子交换高盐缓冲液中。设置流速，接离子柱，高低盐各处理离子柱三次，最后用缓冲液平衡离子柱。上样，待样品进入系统内后，将模式由Inject改为Load。用0%～50%质量分数的GST-HDAC8离子交换高盐缓冲液进行梯度洗脱，1 mL/tube进行适当收集。SDS-PAGE跑胶鉴定。

凝胶过滤层析（Superdex 200），按系统操作执行进行洗泵，结束后将泵头A、B放入到抽滤过的GST-HDAC8分子筛缓冲液中。设置流速，接柱，用GST-HDAC8分子筛缓冲液平衡Superdex 200。上样，收集0.5 mL/tube。SDS-PAGE跑胶鉴定。

1.3.2　GST pull-down的方法寻找互作蛋白

Hela细胞的收集与裂解，刮下细胞，离心，冰PBS清洗三次，置于冰上。用RIPA裂解液，取适量加入细胞中冰上裂解30 min，离心，取上清备用。GST-HDAC8和GST标签蛋白的固化，介质混匀。取200 μL介质悬液分别于至1.5 mL EP管中，标为A、B管，4000 rmp离心5 min，小心弃掉上清。洗杂。重复以上步骤3次。根据蛋白定量将等量的GST-HDAC8蛋白和GST标签蛋白移入预冷的装有谷胱甘肽介质的A、B管中，4℃，旋转结合3h。取出EP管，小心弃掉上清。往EP管中加入1 mL PBS，轻轻颠倒混匀，4℃，4000 rmp离心 5 min，小心弃掉上清。按1:500的比例加入Hela细胞的总蛋白裂解液，轻轻颠倒混匀，4℃，结合12 h。次日，用2×GSH将融合蛋白洗脱，各步骤取样跑胶，质谱鉴定。

2　结果与讨论

2.1　pGEX-6p-1-hHDAC8的表达纯化

本实验将pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白，经超声破碎前后，分别取全菌、上清、沉淀、穿透、洗杂、洗杂后的柱料、洗脱、洗脱后的柱料的样，洗脱步骤可以完全洗脱下目的蛋白，几乎无目的蛋白残留于柱料上，pGEX-6p-1-hHDAC8蛋白的亲和层析各步骤的结果如图1。

结果如下：由于HDAC8蛋白与GST融合蛋白相对分子质量是67 KD左右，所以由亲和层析图可以看出，HDAC8融合蛋白出现在洗脱样品中，可以进行下一步的实验。我们将洗脱液经过换buffer之后浓缩到1.5 mL，采用阴离子交换柱Hitrap Q进行纯化，平衡离子柱用低盐缓冲液，蛋白洗脱将盐浓度由0 mM拉至500 mM NaCl，初期的上样过程蛋白有穿透峰，当电导为24 mS/cm左右时，即开始出现目的蛋白峰，如图2，SDS-PAGE结果显示34管-46管均为目的蛋白，取37-46管进行下一步纯化，如图3。

图2pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q阴离子交换峰形图

图3pGEX-6p-1-hHDAC8 Hitrap Q阴离子交换SDS-PAGE结果

取第37～46管用10 KD浓缩管进行浓缩，浓缩到500 μL左右的时候，使用Superdex 200进行进一步的纯化，平衡Superdex 200，保持离子浓度在150 mM NaCl，上样，洗脱，从10 mL到13 mL出现了杂峰，14 mL左右开始出现目的蛋白峰，峰形单一对称，按照峰宽收集蛋白跑胶，如图4，SDS-PAGE结果显示 14～26 管均为目的蛋白 HDAC8（67 KDa），取第18～26管进行浓缩，-80℃备用。

图4　pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子筛峰形图

2.2　GST标签蛋白的纯化

本实验将GST标签蛋白，经超声破碎前后，分别取全菌、上清、沉淀、穿透、洗杂、洗杂后的柱料、洗脱、洗脱后的柱料的样，洗脱步骤可以完全洗脱下目的蛋白，几乎无目的蛋白残留于柱料上，GST标签蛋白的亲和层析各步骤的结果如图6。白，取2-32管进行下一步纯化备用，如图8。

图5pGEX-6p-1-hHDAC8 Superdex 200分子筛SDS-PAGE结果

图6GST标签蛋白亲和层析SDS-PAGE结果

图7　GST标签蛋白hitrap Q阴离子交换峰形图

结果如下：由于GST蛋白的相对分子质量25 KD左右，所以由亲和层析图可以看出，GST蛋白出现在洗脱样品中，可以进行下一步的离子交换实验如图7。SDS-PAGE结果显示2-32管均为目的蛋

图8　GST标签蛋白hitrap Q阴离子交换SDS-PAGE结果

2.3　GST pull-down的方法寻找互作蛋白

本实验将GST pull-down各个步骤取样，SDSPAGE跑胶，结果如图9。

图9GST pull-down寻找HDAC8互作蛋白

将样品GST-HDAC8+全细胞的样进行质谱送样，结果如图10。

图10GST pull-down寻找HDAC8互作蛋白质谱结果图

我们除了发现文献中报道的蛋白，还发现了多个未见报道的蛋白，如糖代谢过程中发挥重要作用的烯醇酶ENO1，第一次验证了ENO1可能作为HDAC8复合物发挥作用过程中的其中之一蛋白。

3　结论

我们开展了GST pull-down实验，GST pulldown实验结果，除了发现文献中报道的蛋白，还发现了多个未见报道的蛋白，如糖代谢过程中发挥重要作用的烯醇酶ENO1，第一次验证了ENO1可能作为HDAC8复合物发挥作用过程中的其中之一蛋白。与其他寻找HDAC8互作蛋白的方法相比较，作为参照与互补，GST pull-down实验存在的缺点，主要是因为GST标签蛋白占据了HDAC8蛋白的表位，影响了酶的拓扑结构，造成假阴性和假阳性的结果，我们将在今后提出方法模拟酶过渡态设计的底物抑制剂分子，一方面，抑制剂分子占据了酶活中心，没有占据其它位点，不影响酶的拓扑结构；另一方面，该抑制剂分子和HDAC8的结合模拟了底物与酶结合的过程，使“抓取”到的互作蛋白结果更加可靠，本实验的目的是通过pull-down发现一些未被发现的互作蛋白，同时，可以将此方法平移到其它HDAC亚型。

ENO1是发现的未知互作蛋白，我们后期再通过“凸凹互补”的亲和柱实验继续验证此类蛋白，是否与HDAC8存在互作关系。

参考文献：

[1]Berger S L.The complex language of chromatin regulation during transcription[J].Nature,2007,447(7143):407-412.

[2]De Ruijter A J,Van Gennip A H,Caron H N,et al.Histone deacet⁃ylases(HDACs):characterization of the classical HDAC family[J].Biochemical Journal,2003,370(3):737-749.

[3]Gregoretti I,Lee Y-M,Goodson H V.Molecular evolution of the histone deacetylase family:functional implications of phylogenetic analysis[J].Journal of molecular biology,2004,338(1):17-31.

[4]Fischle W,Kiermer V,Dequiedt F,et al.The emerging role of class II histone deacetylases[J].Biochemistry and Cell Biology,2001,79(3):337-348.

[5]柴政斌，张更林，韩金祥．GST pull-down技术在研究蛋白质相互作用中的应用[J]．中国生物制品学杂志，2013．

[6]王学政，张更林，崔亚洲，等．牙本质基质蛋白1功能片段的融合表达及细胞定位[J]．中国生物制品学杂志，2013；26(4)：491-494．