香蕉枯萎病菌快速检测技术

陈帆

香蕉枯萎病作为一种检疫性病害，主要侵染带菌的球茎、病株残体及带菌土壤，并随病株残体、带菌土壤、农耕工具等进行传播，严重影响我市香蕉产业的发展。本研究运用双重抑菌法，对采自漳州各地蕉园的香蕉组织和土壤样本进行处理，以达到快速检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的目的。同时，通过鉴定菌落形态及ITS-SCAR檢验确定标的菌。

1 检测材料与方法

1.1 采样地点及样本类型

土壤样本来自漳州市赤湖、天宝镇后寨村、芗城区浦南镇松洲村等地香蕉园。

1.2 土壤悬浮液中选择性抑菌剂的确定

把采集的土壤样本配制成土壤悬浮液，分别加入0.1 g.L-172 %甲霜灵、50 %异菌脲、25 %咪鲜胺、40 %睛菌唑、25 %三唑酮和70 %恶霉灵作为土壤悬浮液中;同时分别加入0.1 g.L-1硫酸链霉素（Streptomycin Sulfate）作为细菌抑菌剂。以未添加杀菌剂的土壤悬浮液以为对照。将混有不同抑菌剂的土壤悬浮液涂布在KM培养基上，7 d后观察菌落生长情况。

1.3 土壤悬浮液中抑菌剂最适浓度的选择

将1.2实验中筛选出的抑菌剂F1，采用黄金分割法稀释0.618倍、0.6182 倍、0.6183倍，配制成抑菌剂F2、抑菌剂F3、抑菌剂F4，将含有4种不同浓度抑菌剂的土壤悬浮液分别涂布在KM培养基上，恒温培养， 7 d后观察菌落生长情况（表1-1）。

1.4 土壤悬浮液中抑菌剂作用时间的确定

将混有最佳抑菌浓度的土壤悬浮液分别静置10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，在KM培养基上均匀涂布每一时间段的土壤悬浮液，观察菌落生长情况和颜色特征。

2 结果与分析

2.1 土壤悬浮液中抑菌剂筛选

试验结果显示：硫酸链霉素分别和咪鲜胺、三唑酮组成的抑菌剂A和抑菌剂B对标的菌和非标的菌均有很强的抑制作用（图2-1，A-B）。硫酸链霉素分别和异菌脲、和睛菌唑、恶霉灵组成的抑菌剂C、抑菌剂D和抑菌剂E难以分离出标的菌且仍有少量非标的菌生长（图2-1，C-E）。而硫酸链霉素和甲霜灵组成的抑菌剂F在KM培养基中分离出的菌落较为单一，生物学特征明显（图2-1，F）。可见：在土壤悬浮液中添加由甲霜灵和硫酸链霉素组成的抑菌剂F可有效分离出香蕉枯萎病菌4号生理小种且抑制了其他杂菌的干扰。

2.2 土壤悬浮液中抑菌剂最适浓度的确定

在KM培养基上涂布含有不同浓度抑菌剂的土壤悬浮液，试验结果显示：抑菌剂F1和抑菌剂F2在培养8d后才长出较少的标的菌，且性状不明显;抑菌剂F3能够在3 d内长出标的菌，且数量适中，特征明显。抑菌剂F4由于浓度偏低，标的菌和非标的菌均有生长（图2-2）。可见，由甲霜灵0.053g.L-1，硫酸链霉素0.115g.L-1组成的抑菌剂F3为最适浓度。

2.3 土壤悬浮液中抑菌剂作用时间的确定

在 KM培养基上均匀涂布含有抑菌剂F3的土壤悬浮液，静置10-40 min，由于时间较短，标的菌落数较多、较小，形态特征不明显，且尚有非标的菌生长;静置60 min，可促进标的菌有效生长且性状明显，而且强烈抑制了非标的菌生长。而静置80min后菌落数开始减少，菌落形态特征不明显。可见，由甲霜灵0.053g.L-1和硫酸链霉素0.115g.L-1组成的抑菌剂F3，对土壤悬浮液处理60 min可显著提高KM培养基对香蕉枯萎病菌4号小种的选择性（图2-3）。

抑菌时间（min）

2.4 KM培养基双重选择检测结果

试验结果显示：将未含有抑菌剂F3的土壤悬浮液涂布在KM培养基上能分离出香蕉枯萎病菌4号小种，但是菌落较小、特征不明显，且仍有其他杂菌生长。而采用双重选择抑菌法，即在KM培养基上均匀涂布含有抑菌剂F3的土壤悬浮液可检测出单一的香蕉枯萎病菌4小号种（图2-4）。

A： KM培养基单抑菌检测;

B： KM培养基双重抑菌检测

2.5 ITS-SCAR检测

运用双重抑菌法分离出来的菌落，通过ITS-SCAR检测确定为香蕉枯萎病菌4号生理小种（图2-5）。

3 讨论

由于前人研制的KM培养基能够较好分离出单一的香蕉枯萎病菌4号小种，但在实践中仍易受其他杂菌干扰。为了提高培养基的专化性及灵敏度，通过选择最适浓度抑菌剂及恰当的作用时间对带病土壤悬浮液进行处理，既提高了对香蕉枯萎病菌4号小种的选择性而且有效抑制其他杂菌的生长，达到了快速检测的目的。