大黄提取物对急性胰腺炎模型大鼠的治疗作用及机制

曹砚杰　李琨琨　靳　莉　吴慧丽

(郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南　郑州　450007)

大黄是我国著名特产药材，其单味或组方常用于治疗急性胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、消化道出血、肝炎、急性扁桃体炎及出血症等。研究发现，大黄提取物可改变急性胰腺对其他其器官的炎症反应，减轻肺组织、肝组织的充血、水肿等炎性反应〔1〕。体外实验证明，大黄提取物对胰腺腺泡细胞损伤具有一定的保护效果〔2〕。本实验采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠溶液的方法建立大鼠急性胰腺炎模型，并灌胃不同剂量的大黄提取物，观察大鼠血清中血淀粉酶(AMS)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α，胰腺组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平及单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2的表达，并观察胰腺组织病理学变化。

1　材料和方法

1.1材料、药品与试剂SPF级SD大鼠60只，体质量220～250 g，购于广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0002，合格证书号：2008A056。自由饮水、标准饲料，购回后适应性饲养3 d后开始实验。大黄提取物(南京泽朗医药科技有限公司)；牛磺胆酸钠(美国Sigma 公司)；甲磺酸加贝酯(美国 AEMZO 公司)；AMS、IL-6、TNF-α(美国 ADL 公司)；MCP-1、MIP-2(Santa Cruz Biotechnology,Inc)；SOD、MDA(南京建成)；3K18型低温高速离心机(美国Sigma 公司)；VORTEX-GENIUS3 型涡旋振荡器(德国IKA 公司)；CH30型光学显微镜(日本Olympus 公司)；GB11240-89型电热恒温水浴锅(北京市医疗设备意成公司)；ELX800全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

1.2实验动物分组与模型制作SD大鼠随机分为正常组，模型组，阳性药组，大黄提取物低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，采用逆行胰胆管注射 5%牛磺胆酸钠溶液(1 ml/kg)建立急性胰腺炎大鼠模型，造模30 min后，大黄提取物低、中、高剂量组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg灌胃，正常组和模型组给予1.0 g·kg-1·d-1生理盐水灌胃，阳性药组给予腹腔注射甲磺酸加贝酯10 mg/kg。分别于给药12 h后乙醚麻醉，眼内眦取血离心取血清，之后处死大鼠摘取胰腺组织，部分组织置入10%中性甲醛缓冲液固定。其余胰腺组织分装于离心管中-80℃冰箱保存。

1.3胰腺组织学观察取胰腺头部组织置于10%甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，置于显微镜下观察组织病理学变化。

1.4血清中AMS、IL-6、TNF-α含量测定各组大鼠眼内眶取血，低温条件下5 000 r/min离心10 min，取上层血清，用于测定AMS、IL-6、TNF-α含量，检测方法按照各试剂盒说明书操作。

1.5胰腺组织SOD及MDA的测定取部分胰腺组织，冲洗干净，吸水纸吸干，称重，置入10 ml离心管内，加入适量生理盐水，匀浆制成10%的组织匀浆，4℃ 3 500 r/min离心10 min，取上清液测定SOD、MDA 的活性。各指标测定严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6Western印迹法检测胰腺组织中MCP-1和MIP-2蛋白表达取胰腺组织裂解后，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，采用湿转的转膜方式进行电泳，测定胰腺组织中MCP-1和MIP-2的蛋白表达。

1.7统计学方法采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2　结　果

2.1胰腺组织病理学检查正常组大鼠胰腺组织小叶结构完整，边缘清晰，形态正常，无水肿，未见炎症细胞浸润，腺泡结构完整，轮廓清晰，胞质和核仁着色清晰可见。模型组大鼠胰腺组织小叶结构较紊乱不整齐，间隔距离明显增大，存在大量坏死细胞，可见大量炎症细胞浸润，腺泡水肿及破裂，核仁固缩，出血点较多，有大量红细胞渗出。阳性药组胰腺组织小叶结构相对紊乱，腺泡出现轻微水肿，存在少量炎症细胞浸润，出血点比较少。大黄提取物各剂量组大鼠胰腺组织小叶结构相对整齐，腺体结构轻微紊乱，腺泡轻微水肿，有少量的炎症细胞浸润，出血点少，有少量的红细胞渗出；与模型组相比，胰腺水肿、炎症浸润、出血点及充血方面显著减轻。见图1。

2.2大黄提取物对血清中AMS、IL-6、TNF-α活性的影响与正常组相比，模型组血清AMS、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01)；阳性药组血清AMS、IL-6、TNF-α水平均较模型组明显降低(P<0.01)；与模型组相比，大黄提取物低、中、高剂量组血清中AMS、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01)。见表1。

2.3大黄提取物对胰腺组织中SOD及MDA含量的影响与正常组相比，模型组胰腺组织SOD含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，大黄提取物低、中、高剂量组SOD均有明显升高(P<0.05或P<0.01)，不同的大黄提取物组间有一定的量-效关系趋势，但中剂量与高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比，模型组胰腺组织MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，大黄提取物低、中、高剂量组MDA均有明显降低(P<0.01)；与阳性药组相比，低、中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组降低更明显(P<0.05)。见表2。

表1　各组血清AMS、IL-6、TNF-α活性比较

与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

2.4大黄提取物对胰腺组织中MCP-1和MIP-2蛋白表达的影响与正常组相比，模型组胰腺组织中MCP-1、MIP-2表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，大黄提取物低、中、高剂量组MCP-1、MIP-2表达水平均显著降低(P<0.05)，而正常组和阳性药组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

表2　各组胰腺组织SOD、MDA含量的比较

与正常组比较: 1)P<0.01；与模型组比较: 2)P<0.05,3)P<0.01

1～6：正常组，阳性药组，模型组，提取物低剂量组，提取物中剂量组，提取物高剂量组图2　胰腺组织中MCP-1、MIP-2蛋白表达比较

3　讨　论

急性胰腺炎是临床常见的一种急腹症，发病机制复杂，具有很高的发病率，其发病急、病情发展凶险，严重者可发展为重症急性胰腺炎，甚至多器官衰竭，死亡率高达5%～13.6%〔3〕。研究表明，多种炎症因子参与了早期急性胰腺炎的病理发展过程。早期急性胰腺炎引发多种炎症介质释放入血，引发急性炎症反应，导致肠黏膜屏障功能受损，使胰腺及胰腺外坏死组织内细菌和内毒素增加，坏死组织被感染，引起多种趋化因子、炎症因子等大量释放，过度激活中性粒细胞，导致胰腺水肿、出血、坏死，最终发展成严重的全身炎症反应综合征〔4〕。大量实验研究表明〔5～7〕，逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠法建立急性胰腺炎大鼠模型在研究中应用最广泛，模型反应与人类相似，而且操作简单易行，重复性好。本研究结果也说明急性胰腺炎模型复制成功。AMS是诊断急性胰腺炎常用的生化指标，可以反映急性胰腺炎的治疗效果。IL-6 和TNF-α是促炎症细胞因子，在急性胰腺炎早期，体内 IL-6、TNF-α等水平明显升高，其与多种细胞相互作用，引起胰腺组织损伤〔8〕。SOD是脂质氧化过程中形成的脂质过氧化物，能够清除氧自由基，过量的氧自由基会导致MDA含量升高，二者同样是检测炎症反应的关键指标〔9〕。研究证明，机体分泌适量的TNF-α可发挥免疫调控、抗感染等效果，而过多分泌或分泌失控时反而会刺激炎症细胞产生多种促炎症因子和氧自由基，进一步引起脓毒血症和感染〔10，11〕。因此，调节促炎性细胞因子的水平是控制急性胰腺炎病情进展的重要手段。本研究结果说明大黄提取物能通过抑制IL-6和TNF-α等促炎症因子的释放，对急性胰腺炎大鼠炎症反应起到一定程度的缓解作用。

炎症反应过程会引起中性粒细胞在炎症区域聚集，期间伴有许多趋化因子，后期修复过程中趋化因子起重要的作用。MCP-1属于趋化因子 CC β亚家族，对单核巨噬细胞和淋巴细胞能够高度特异性的趋化和启动，参与机体免疫应答的调节；MIP-2是CXC 趋化因子超家族成员〔12～14〕。本实验说明大黄提取物可早期控制炎症进程，避免炎症反应进一步发展。

本研究结果提示，大黄提取物对急性胰腺炎大鼠具有一定的治疗作用，并能减轻炎性反应，降低血清中促炎症因子IL-6、TNF-α水平和AMS活力，增加胰腺组织中SOD活力，降低组织中MDA含量，同时下调MCP-1、MIP-2 蛋白表达水平，控制早期炎症进程，避免急性胰腺炎进一步发展。

1周黎明.大黄素作用于大鼠重症急性胰腺炎的分子机理研究〔D〕.成都:四川大学,2006:6-8.

2张桂信.胆汁酸对胰腺腺泡细胞的损伤与大黄素调节作用的实验研究〔D〕.大连：大连医科大学，2009：6-9.

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4Staubli SM,Oertli D,Nebiker CA.Laboratory markers predicting severity of acute pancreatitis 〔J〕.Crit Rev Clin Lab Sci,2015;52(6):273-83.

5Voskanyan SE,Kotenko KV,Korsakov IN,etal.Prediction of the acute pancreatitis after surgery on the pancreas〔J〕.Eksp Klin Gastroenterol,2014;(9):61-8.

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7张芬,杨柳,王浩,等.急性胰腺炎的研究进展〔J〕.现代生物医学进展,2016;5(15):2983-6.

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12Zhao X,Zhang Y,Li J,etal.Tissue pharmacology of Da-Cheng-Qi Decoction in experimental acute pancreatitis in rats〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med,2015;2015:283175.

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14Liang X,Zhang B,Chen Q,etal.The mechanism underlying alpinetin-mediated alleviation of pancreatitis-associated lung injurythrough upregulating aquaporin-1〔J〕.Drug Des Devel Ther,2016;10:841-50.