大型海洋动物标本霉变菌株的筛选与防治探索

郑伟伟，何建瑜，唐 益，魏余兴，樊英萍，陈 健，刘雪珠

(1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.Department of Biology，University of Pisa，Pisa 56125，Italy；3.浙江海洋大学海洋生物博物馆，浙江舟山 316022)

大型海洋动物干制填充标本是将海洋生物整体或部分组织作为样品，经过物理或化学手段防腐，使其能够长久保存，为展示、教学、以及科学研究之用。然而因大型海洋动物标本都为生物有机体，多含有一定量的糖类、脂肪和蛋白质等物质，尽管已做防腐处理，仍易受到霉菌的侵害，发生霉变[1-2]。生物标本的霉变主要发生在其表面[3-4]，不同的霉菌可以产生无性孢子和有性孢子，其生长过程的代谢行为势必对生物体造成霉腐等劣化行为[5-14]，会严重影响到生物标本的观赏和科研价值。目前，我国各海洋生物标本馆的干制填充标本霉变现象非常普遍，但关于霉变的研究报道多数其中于经济作物[7-10，15]，有关大型海洋动物标本霉变与防治几乎没有。本实验旨在从霉变标本上筛选霉变菌株并鉴定，测试几种常见市售防霉剂对霉变菌株的抑制效果，为针对性地筛选有效的海洋生物标本防霉剂提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 霉菌的分离纯化

采样时间为2017年梅雨季节间的6月15日，无菌操作于浙江海洋大学海洋生物博物馆中的银杏齿中喙鲸Mesoplodon ginkgodens的右侧背鳍基底体侧腹部、鲸鲨Rhincodon typus的右侧第2鳃裂至第3鳃裂间及侏儒抹香鲸Kogia sima的尾柄左侧皮肤表面采集霉变样本 (采样部位取决于该部位霉菌生长是否旺盛)，返回实验室后立即进行无菌分离培养[16]。将霉变样品接种于已灭菌处理的马铃薯固体培养基(PDA)[17]，于28℃恒温倒置培养3～5 d，挑取单菌落并反复划线纯化菌株。纯化后的菌种一部分用于鉴定和抑制实验，4℃保存；另一部分制成20%甘油菌悬浮液，-20℃保存。

1.2 菌株鉴定

1.2.1 形态学鉴定

利用载玻片观察培养法，对不同生长阶段的霉菌进行高倍镜镜检，观察分生孢子结构，包括分生孢子头球、分生孢子梗和菌丝，并拍照记录[16，18]。根据霉菌菌落特征及菌株的显微形态初步排除部分重复菌株。

1.2.2 ITS基因鉴定

用真菌DNA提取试剂盒(Fungi Genomic DNA Extraction Kit，Solarbio)提取纯化培养菌株的DNA，采用真菌特异性引物 (ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇和 ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)进行 PCR 扩增[19-21]，50 μL 反应体系为：10×buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μL，ddH2O 35.5 μL，Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL，25 mM MgCl25 μL，模板 DNA 1 μL。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性 20 s，50～60 ℃退火 20 s，72 ℃ 延伸 20～50 s，循环 35次；最后 72 ℃延伸 5 min。PCR 产物纯化后送上海凌恩生物科技有限公司进行DNA序列测定。经GenBank中Blastn序列比对后，用MEGA 5.1中的Neighbor-Joining算法构建系统发育树，进行系统发育分析，系统树每个分支的统计学显著性分析以Bootstrap方法进行检验，重复次数为1 000次[22-24]。

1.3 防霉剂稀释处理

试验选择的4种常用的克霉剂，多菌灵、克霉唑、苯甲酸钠、尼泊金乙酯皆从市场购置。将上述4种不同防霉剂制成安全范围内(安全浓度范围指各防霉剂用量低于小白鼠或狗的口服LD50值)不同浓度的系列溶液，即实验溶液的最大浓度均低于文献报道的安全浓度[25]。其中多菌灵的最大实验浓度为700 mg/L(浓度梯度首次设置为200～700 mg/L，间隔为100 mg/L，后补充550 mg/L及650 mg/L)，克霉唑的最大实验浓度为 15 000 mg/L(浓度梯度分别为 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 和 15 000 mg/L)，苯甲酸钠为 800 mg/L(浓度梯度为200～800 mg/L，间隔为100 mg/L)、尼泊金乙酯为15 000 mg/L(浓度梯度设置同克霉唑)。

1.4 防霉剂抑制霉变菌株试验

将100 μL浓度已知的霉菌孢子悬浮液(1×106±2×105spores/mL)，加入到PDA平板中，涂布均匀，制成菌板。取上述各溶液2.5 μL置于圆形滤纸片(Φ=6 mm)上，制得不同含量的防霉剂滤纸片，滤纸片平贴于上述含菌板中，每种防霉剂每个浓度3次平行试验，溶剂为空白对照。将贴好滤纸片的平板28℃恒温倒置培养。每天观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径[26]。选取抑制效果最优的防霉剂进行最低抑制浓度的测定。

1.5 液体培养法测多菌灵最低抑制浓度

将多菌灵溶液测试浓度配制成0.2～1.6 mg/L共7个梯度，每株菌每个浓度平行3组。每组的配比为：4 mL查氏液体培养基+0.5 mL孢子悬浮液+0.5 mL多菌灵溶液。设空白对照为纯培养基与加孢子悬浮液的培养基。最后将上述试验组与对照组放入摇床140 r/min，28℃恒温培养，观察有无霉菌生成[27]。

1.6 数据处理

试验所得数据用SPSS19.0进行单因子显著性差异分析(One-Way ANOVA)和t检验[28]，以R软件ggplot程序包做图。

2 结果与分析

2.1 霉变菌株的筛选与鉴定

经分离和反复划线纯化，获得8株菌株，再经菌落形态和显微形态观察，去除酵母菌，最终得到6株菌株，分别编号为 D1、D2、D3、D4、D5 和 D6。

10倍目镜下用高40倍物镜观察霉菌形态，菌株D1、D2、D3、D5均具有曲霉属的显著特征，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，呈球形；菌株D4、D6具有青霉属的显著特征，分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中。

2.2 霉菌ITS鉴定结果

利用Blastn从GenBank获取该6株霉菌同源性达99%的相似菌株，对相似菌株的分离源进行分析。经MEGA5.1构建系统发育树如图 1所示，D1、D2、D3和D5与曲霉菌属关系较近，D4和D6与青霉菌属亲缘关系较近。结合显微形态学观察结果，6株霉变菌株的鉴定结果与基因登录号分别为聚多曲霉 A.sydowii D1(MG799216)、日本曲霉 A.japonicas D2(MG799217)、棘孢曲霉 A.aculeatus D3(MG799218)、产黄青霉 Penicillium chrysogenum D4(MG799219)、黄曲霉 A.flavus D5(MG799220)和中文名不详的青霉菌P.hispanicum D6(MG799221)。其中D1菌株来自银杏齿中喙鲸的右侧背鳍基底体侧腹部，D2和D3菌株样品取自鲸鲨右侧第2鳃裂至第3鳃裂间，菌株D4和D5来自鲸鲨眼后部头上皮肤，D6菌株取自侏儒抹香鲸的尾柄左侧皮肤。推测引起不同动物标本的优势菌种存在一定的差异。

图1 基于真菌ITS基因序列的系统发育分析Fig.1 Phylogenetic dendrogram of 6 mildews based on the ITS gene

2.3 4种防霉剂对霉变菌株的抑制作用

4种防霉剂对6株霉变菌株的抑制效果及最佳抑制浓度见表1。结果显示苯甲酸钠 (最高试验浓度8 000 mg/L)和尼泊金乙酯(最高试验浓度15 000 mg/L)在安全范围内所有浓度对6株霉菌均无抑制作用；克霉唑对6种霉菌的抑制作用程度相近。多菌灵对青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6的抑制作用最强，对曲霉菌A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3抑制效果相对较弱，对黄曲霉A.flavus D5的抑制作用最弱。

表1 4种防霉剂对6株霉变菌株的最佳抑制浓度及抑制效果Tab.1 Optimum inhibitory concentration and result of 4 antifungal agents effecting on each mildew

2.4 多菌灵对6株霉菌的抑制效果

多菌灵对6株霉菌菌株的抑制作用如图2所示，在所有浓度中最佳抑制效果如图3所示。结果显示，多菌灵对青霉属的菌株抑制效果优于曲霉属的菌株(P＜0.05)，所有浓度下均能较强抑制P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6(抑菌圈直径＞20 mm)，最佳抑制浓度均为550 mg/L，抑菌圈直径分别为45.5±1.7 mm和41.5±1.0 mm，抑制作用无显著差异(P＞0.05)。多菌灵对曲霉属菌株的抑制作用则存在较大的差异：在相对低浓度(200～500 mg/L)时，多菌灵对 A.aculeatus D3的抑制作用一直处于最高，其次为A.japonicas D2，对A.flavus D5有微弱的作用，而对A.sydowii D1无抑制作用。从550 mg/L开始，多菌灵对菌株A.sydowii D1产生抑制作用，一直维持到最高浓度，抑制水平与A.japonicas D2和A.aculeatus D3相近，且三者的抑菌圈直径显著高于A.flavus D5 (P＜0.05)。虽然所有浓度多菌灵都显示对A.flavus D5的抑制作用，但作用一直较弱，抑菌圈直径均小于12 mm。

图2 多菌灵对6株霉菌的抑制效果Fig.2 The inhibition effect of carbendazim on 6 strains of mildew

图3 多菌灵最佳抑制浓度下6株霉菌的抑菌圈Fig.3 The inhibitive effect of 6 strains under the optimum inhibitory concentration of carbendazim

2.5 多菌灵对6株致霉菌的最低抑制浓度

多菌灵对A.sydowii D1、A.japonicas D2、A.aculeatus D3、P.hispanicum D6的最低抑制浓度(minimum inhibition concentration，MIC)均为0.2～0.4 mg/L，对D4产黄青霉 P.chrysogenum 的MIC值略高，为 0.4～0.6 mg/L(表2)。方贻文在研究脐橙留树贮藏技术时发现多菌灵对黑曲霉、黄曲霉、拟青霉、木霉的MIC分别为1.0、1.5、1.5和0.6 mg/L[7]，均比本次实验从海洋动物标本中所筛选的上述5株霉菌的最低抑制浓度高。然而多菌灵对鉴定为黄曲霉的A.flavus D5菌株的抑制效果较弱，其MIC相对较高为1.6～2.0 mg/L，与上述文献数值较为一致。

表2 多菌灵对6株霉菌的最低抑制浓度(MIC)Tab.2 The minimum inhibitory concentration(MIC)of carbendazim inhibiting the growth of 6 molds

2.6 克霉唑对6株霉菌的抑制效果

克霉唑对6株霉菌菌株的抑制作用如图4所示，在所有浓度中最佳抑制效果如图5所示。结果显示，与多菌灵比较，克霉唑对霉变菌株的抑制作用没有明显的种属差异性，但在同一浓度下对不同菌株的抑制效果也略显不同。所有菌株在低浓度时(2 000 mg/L)就有被抑制现象，产生较明显的抑菌圈，且此浓度下对曲霉菌属的抑制效果略强(抑菌圈直径＞30 mm)。进一步分析发现在所有浓度下(2 000～15 000 mg/L)克霉唑对曲霉属的聚多曲霉 A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2和棘孢曲霉 A.aculeatus D3均有较强抑制效果，最强抑制浓度分别为15 000、4 000和4 000 mg/L(抑菌圈直径分别为38.2±0.6 mm、34.3±2.1 mm和32.7±1.5 mm)。比较奇怪的是除了在浓度为2 000 mg/L时，克霉唑对黄曲霉A.flavus D5的抑制作用略胜于青霉菌P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6外，在其余浓度下抑制作用皆为最弱。对青霉菌属的D4和D6菌株而言，克霉唑能产生较大的抑菌圈(抑菌圈直径＞20 mm)，产生最大抑菌圈的浓度分别为8 000和6 000 mg/L。

图4 克霉唑对6株霉变菌株的抑制效果Fig.4 The inhibition effect of clonazole on six molds

图5 克霉唑最佳抑制浓度下6株霉菌的抑菌圈Fig.5 The inhibitive effect on 6 strains under the optimum inhibitory concentration of clotrimazole

3 讨论

国内外对于防霉的研究多数集中于经济作物、木材及饲料等的储存及霉菌病的防治上[29-34]，还未见有针对海洋动物标本霉变的防治研究。采用常规分离纯化方法，结合形态学观察及ITS序列分析共获得6株引起海洋动物霉变的菌株，4株为曲霉菌，2株为青霉菌。聚多曲霉A.sydowii D1和日本曲霉A.japonicas D2在霉变微生物中较为少见[35-36]，棘孢曲霉A.aculeatus D3和青霉菌P.hispanicum D6未见有报道出现在其他材料的霉变样品中。研究还发现6株菌来源于不同样品源，引起海洋生物干制标本霉变菌株具有一定的特异性，推测可能与标本质地有关。要全面了解引起海洋生物标本霉变菌，下一步研究需要进行更广泛的取样。

分析4种市售防霉剂对各霉变菌株的抑制效果，研究发现只有多菌灵和克霉唑对本实验的标本霉变菌株有抑制效果。多菌灵对青霉属的P.chrysogenum D4和P.hispanicum D6抑制效果最佳；对聚多曲霉A.sydowii D1、日本曲霉A.japonicas D2、棘孢曲霉A.aculeatus D3抑制相对弱一些，且聚多曲霉A.sydowii D1对多菌灵的浓度敏感性较强；对黄曲霉A.flavus D5的抑制作用更弱，这可能和多菌灵的抑菌机制有关(多菌灵可与纺锤丝的微管蛋白质相结合从而对有丝分裂进行干扰。但是纺锤丝微管蛋白质的细微改变都可降低多菌灵与微管蛋白质的结合力，因而易引起抗药性[37]。)，同一浓度对不同菌株的抑制作用存在着显著差异(P＜0.05)，显示多菌灵在防霉效果上有一定的物种选择性。相反，克霉唑对曲霉属的菌株抑制效果略强于青霉属的菌株，但差异不大，同一浓度对不同菌株的抑制作用差异也较小，显示为较广谱的抑制效果。在相同浓度下两种防霉剂对常见腐霉菌黄曲霉的抑制作用都较弱，黄曲霉菌是否已经对现有防霉剂产生一定的耐药性值得进一步研究。市售防霉剂对食品、木材等有作用的化学防霉剂不一定对海洋生物标本防霉有效，不同的防霉剂对同一菌株的抑制效果不同，同种防霉剂对不同霉变菌株的抑制效果也不同，有必要在后续实验中更广泛地筛选市售防霉剂。张明辉在研究抑制蓝湿革霉菌生长时采用复配防霉剂的防霉性能明显提高，复配浓度和各自的最低抑菌浓度都有显著下降[26]。提示除了广泛筛选防霉剂外，还可进行混合配比研究，以期得到对海洋生物标本霉变菌有更强抑制作用、安全性更好的混合防霉制剂。