禾本科植物细胞壁合成调控研究进展

胡炜晨， 张 同， 胡 振， 王令强

(华中农业大学植物科学技术学院/华中农业大学生物质和生物能源中心，湖北 武汉 430070)

植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、木质素等构成的网状结构，是植物细胞区别于动物细胞的基本特征之一。细胞壁与植物生长发育密切相关，维持细胞的基本形态，为植株提供机械支撑。此外，细胞壁还在营养物质转运、信号传导、花粉开裂、育性、抵御外界环境胁迫等方面发挥广泛的作用。

作物茎秆强度反映了细胞壁的物理特性，是一个重要的农艺性状，与产量、抗性等直接相关[1-3]。另外，纤维素、木质素等细胞壁成分可作为重要的化工原料。特别是近些年来，木质纤维素作为第二代生物能源物质，因清洁可再生，兼具能源、材料和环保的综合效率，正日益受到关注[4]。

秸秆的理化性质如抗倒伏性能的改善、秸秆综合利用效率的提高都有赖于对细胞壁合成调控机理的认识[5-7]。同时，细胞壁作物植物区别于动物的一个进化特征，其形成和调控的分子机制是一个有待于研究的基础科学问题。2005年，Science杂志在其创刊125周年时就提出把“植物如何形成细胞壁”作为接下来25年需要解决的重要科学问题之一[8]。近十多年来，植物细胞壁合成调控分子机制研究已在国内外引起重视，并且取得了一定的发展。本文以农作物水稻、小麦和玉米为对象，从研究策略的角度综述了禾本科植物细胞壁合成调控的研究进展。

1 茎秆突变体在禾本科植物细胞壁合成调控研究中的应用

茎秆突变体(易脆、倒伏等)是研究植物细胞壁的宝贵材料。目前，在拟南芥、水稻、玉米、大麦、小麦和高粱等中均发现了茎秆突变体。采用正向遗传学研究策略，通过发现和创建突变体，开展基因图位克隆和功能研究，为植物细胞壁合成调控机理的研究打下了基础。

1.1 水稻茎秆突变体的发现和基因克隆

水稻(OryzasativaL.)是重要的粮食作物，也是单子叶模式植物。禾本科植物细胞壁合成调控机理的认识主要来自于对水稻的研究。自1963年Nagao等[9]首次发现水稻脆茎突变体bc1以来，已有50多年历史。早期发现的6个脆秆基因(bc1～bc6)，有5个通过经典遗传学的三体定位法定位在不同的连锁群上[10]。但直到2003年，中国科学家克隆了水稻脆秆突变体基因bc1，才有了突破性进展。bc1主要在厚壁组织细胞和维管束中编码一个胞外磷脂酰肌醇(GPI)锚定类Cobra蛋白，突变降低细胞壁厚度和纤维素含量，增加木质素含量[11]。随后，2003年Tanaka等[12]发现了3个新的脆秆基因，分别编码水稻纤维素合酶3个亚基(OsCESA4、OsCESA7、OsCESA9)，位于第1、10染色体，与以前的脆秆基因不等位。2007年，Yan等[13]克隆了bc7(t), 并发现该基因就是纤维素合酶基因4(OsCesA4)。与Tanaka等[12]报道的OsCesA4不同，该突变体株高没有改变。此后，每年都有脆秆基因的发现和克隆，如bc3[14-15]、bc10[16]、bc11[17]、bc12[18]等。Zhou等[16]克隆了bc10，研究结果表明bc10编码植物中新发现的一个糖基转移酶，该酶在高尔基体中合成，突变影响了纤维素和阿拉伯树胶酸蛋白(AGPs)的合成。Li等[19]克隆的一软秆易倒伏基因(fc1)编码木质素合成途径中肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)，主要在维管束厚壁细胞的次生细胞壁中表达，突变造成纤维素、木质素含量和H单体含量的降低，细胞壁变薄。BC14 编码尿苷二磷酸葡萄糖转运蛋白, 该转运蛋白能将核苷酸糖从胞质运入高尔基体中，它的缺陷造成众多含葡萄糖基的多糖合成异常[20]。这些研究初步揭示了水稻细胞壁合成调控分子基础，表明细胞壁合成涉及各细胞学过程，其中包括参与纤维素催化合成(如BC1、BC11)、基质多糖形成/糖蛋白修饰(BC10/fc116)、细胞壁骨架的形成(BC12)以及囊泡运输(BC3)等。2011年，Zhang等[21]总结了水稻脆秆基因图位克隆和功能研究进展，阐述了脆秆突变体在细胞壁合成调控机理研究中的重要性。最近几年，水稻中仍有脆秆基因(bc13[22]、bc14[20]、bc15[23])的克隆和报道。这些突变体基因的克隆和研究不断丰富我们对禾本科细胞壁合成调控机理的认识。

1.2 禾本科植物细胞壁合成调控机理的复杂性

茎秆突变体的研究结果和基因克隆实践表明，植物细胞壁合成调控机理复杂。从基因性质来说，细胞壁合成变化不仅与负责其成分物质合成的基因直接相关，而且还与一些起降解作用的纤维素酶(Korrigan)和类几丁质酶(Chitinase-like)密切联系。Bc15编码没有几丁质酶活性的水稻类几丁质酶，突变后引起茎秆厚壁细胞纤维素含量降低，次生细胞壁变薄[23]。有些茎秆强度突变体是通过改变纤维素微纤丝的定向沉积而影响茎秆强度，如bc12[18]。研究结果表明，COBRA类蛋白BC1N端碳水化合物结合结构域(Carbohydrate binding module,CBM)可结合结晶态纤维素，通过调节其微纤丝结晶度来影响次生细胞壁的薄厚及茎秆机械强度[24]。从细胞壁组成看，三大成分纤维素、半纤维素和木质素中任何一个改变，均可以导致整体上细胞壁结构和功能的改变。而这种改变可能涉及基因调控也可能是结构上的一个物理性互补。而且，初生细胞壁相关基因的改变也可进一步导致次生细胞壁的变化。对半纤维素的修饰如乙酰化和去乙酰化，可造成次生细胞壁的改变[25-26]。初生细胞壁和次生细胞壁的相互关系，以及初生细胞壁和次生细胞壁的基因分类和功能有待进一步明确。另外，禾本科植物细胞壁合成调控网络研究正方兴未艾。目前有2篇报道分别利用候选基因转化和图位克隆法研究了水稻中转录因子(OsMYB103L)对细胞壁合成的调控机制[27-28]。MYB转录因子可以调控纤维素合酶基因的表达水平，进而使植株纤维素含量及茎秆强度发生改变[27]。张保才等[29]从植物细胞壁结构与成分、细胞壁物质合成、细胞骨架在细胞壁形成中的作用、细胞壁形成的信号与转录调控网络以及研究技术的发展等几个角度阐述了植物细胞壁合成调控的新进展。这几年的研究重点，主要体现在基因的转录调控、纤维素合成复合体、非纤维素多糖修饰、外界环境和激素的调控，以及细胞壁各组分间的协同变化等几个方面。

1.3 茎秆突变体在细胞壁研究中的局限性

茎秆突变体为细胞壁合成调控的研究提供了切入点，在研究的早、中期发挥了重要的作用。但该方法的局限性在于：(1)材料难获得。由于家族基因互补等原因，有些细胞壁相关基因突变后性状无明显变化，很难通过表型鉴定获得。(2)依赖图位克隆，过程较漫长。水稻中虽然有很多T-DNA等插入突变体，理论上可利用侧翼序列分离等方法克隆基因，但成功不多。目前只有CESA(Tos17)和fc1(T-DNA)克隆报道[12,19]。(3)重复性难避免。克隆的基因往往与已发表的基因等位，如本实验室发表的fc116/bc10[30]和OsCESA9[31]。(4)绝大多数为结构基因，对细胞壁合成起直接作用，网络中上游的调控基因难以发现。水稻中通过茎秆突变体图位克隆的转录因子基因，目前只有OsMYB103L[28]。因此，随着研究手段的多样化，茎秆突变体已不再扮演主要角色。尽管如此，目前仍有脆秆基因被陆续发现和克隆，如bc16、bc17、BS1的克隆。因此，脆秆突变体的研究在细胞壁合成调控研究中仍发挥作用。

2 秸秆细胞壁相关性状的数量遗传学研究进展

植物细胞壁理化性质是多基因控制的复杂性状。定位和研究秸秆细胞壁数量性状位点(QTL)，进而克隆相关基因进行功能研究和利用，是另一种正向遗传学研究手段。秸秆相关性状的遗传学研究，早期仅有一些抗倒伏、茎秆木质化性状以及饲料纤维素和木质素含量和可消化性的QTL的定位报道。随着对生物质饲料和生物质能源的重视，目前玉米、大麦、燕麦、小麦和水稻等禾本科作物的细胞壁性状遗传学研究取得了一定的进展。

2.1 玉米秸秆相关性状的QTL定位

玉米是重要的青储饲料，又是美国等国家重视的能源作物，所以较早开展了秸秆细胞壁相关性状的数量遗传学研究。叶鞘和茎秆的中性可洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸可溶木质素(ADL)性状的QTL定位研究结果[32-34]表明秸秆性状存在相关性，相关QTL位置和效应有一致性，比如对纤维性状QTL的选择可提高秸秆的可消化性。另外，发现QTL与纤维素或淀粉合成途径的基因连锁。Barrière等[35-36]利用F838×F286重组自交系对控制木质素含量、木质素单体含量和对羟基肉桂酸含量以及细胞壁可降解性的QTL进行了定位。Barrière等[37]利用WM13和Rio杂交的重组自交系定位了木质素含量QTL。其中一个影响Klason木质素含量的主效QTL可解释43%的遗传变异；另外还定位了对羟基肉桂酸含量QTL 13个、木质素单体含量QTL 9个。该研究进一步与前人的5个RIL群体的结果进行系统比较总结，一共得到50个QTL与ADL/NDF有关，涉及23个单一位点，有53个QTL与体外消化率(IVNDFD)有关。研究发现细胞壁相关性状QTL往往成簇分布，还存在很多QTL并没有与细胞壁单体合成和多聚化相关的基因对应，推测这些位点可能与对木质素合成和次生细胞壁沉淀的调控基因有关，有待进一步研究。

2.2 其他禾本科作物秸秆相关性状的QTL研究

除玉米外，在燕麦和大麦中也已检测了一些影响细胞壁可消化性、纤维品质、木质素含量、半纤维素成分、糖成分等相关性状的QTL[38-39]。小麦中茎秆强度、茎粗和秆壁厚度相关性状QTL可较好地用于小麦抗倒伏选择育种[40-41]。值得一提的是，在对大麦半纤维素成分MLG含量的QTL定位中，发现一主效QTL，对该QTL精细定位，并利用水稻同源区段比较克隆和验证了该基因功能，研究结果发表在Science杂志上[42]。而在水稻中，Okawa等[43]利用染色体片段代换系鉴定出茎秆厚度QTL(SCM2)并将其克隆，发现其与影响穗结构的APO1基因等位。研究进一步发现携带SCM2的近等基因系茎秆强度增强同时穗粒数增加。该研究结果为提高水稻的抗倒伏能力和产量提供了新思路。

2.3 禾本科植物细胞壁成分和酶解产糖效率的QTL研究

尽管植物细胞壁相关性状的QTL定位逐渐增多，但真正涉及细胞壁理化性质的定位不多。在秸秆抗倒伏研究方面，由于指标和群体问题，真正与秸秆密切相关的QTL很少定位到，目前也没有从细胞壁组成和结构特性等内在层面展开。在秸秆相关化学性状方面，由于缺乏高效的细胞壁分析平台，对细胞壁单糖组成和木质素单体的定位还很少，也几乎没有生物质能源转化效率的数量遗传学研究。拟南芥中最早开展了细胞壁成分如木质素相关性状和可降解性的QTL定位研究[44-45]。在玉米中，利用玉米品种B73和Mo17构建重组自交系，定位了152个玉米秸秆酶解葡萄糖释放量和细胞壁组分相关的QTL，为能源作物分子标记辅助选择打下了基础[46]。随后的Barriere[36-37]的QTL定位研究也涉及了一些秸秆木质素单体和可降解性。2014年，Penning等[47]利用玉米重组自交系对木质素含量和酶解产糖进行了QTL定位，检测到木质素含量、4-乙烯基苯酚含量和酶解产糖相关的QTL，在该群体中苯酚类物质含量的QTL与糖释放量的QTL并无关系，他们推测有其他非木质素细胞壁因子影响了该群体的酶解转化效率。在水稻中，Zhang等[21]利用野生稻Yuanj和Teqing的导入系群体定位了与半纤维单糖含量相关的QTL，其中4个木糖和葡萄糖含量相关的QTL贡献率可达20%。最近在四倍体小麦和二棱春大麦中，利用自然群体对阿拉伯木聚糖含量进行了关联分析[48-49]。这些秸秆细胞壁成分相关QTL的定位，给秸秆农艺性状的遗传改良带来了便利，也为随后的基因克隆建立了基础。

2.4 植物细胞壁组成和酶解产糖效率分析平台在数量遗传学研究中的应用

长期以来，缺乏快速、准确的性状测定方法而无法完成对大规模群体的分析，是细胞壁数量遗传学研究的瓶颈。最近，近红外光谱分析技术(NIR)和高通量细胞壁分析测定技术平台在生物质能研究领域的应用值得关注。NIR具有快速、无损、环保、无前处理的特点，可实现对大量样本的高通量测定[50]。目前，该技术已应用于生物质和生物能源领域，例如秸秆的化学成分测定[51]，大麦燃料酒精品质和谷类种子产生酒精的潜力[52-53]，小麦秸秆细胞壁成分分析及秸秆的可降解性预测[54-55]。Templeton等[56]利用近红外光谱技术结合偏最小二乘法(NIR/PLS)测定了来自美国8个玉米种植带的508份商业化杂交玉米秸秆样品细胞壁成分的变异。最近，本课题组利用NIR对不同预处理条件下芒草和水稻细胞壁成分和酶解转化效率进行了近红外建模[57-58]。

最近几年开发的一些细胞壁成分自动化分析系统，可采用不用预处理模式，实现对大规模样品的分析。这些分析系统具有快速、重复性好、精密度高、结果可比性强等明显优点，可用于生物能源研究和其他工业生产[59-60]。美国能源部大湖能源研究中心(DOE-GLBRC)开发的高通量木质纤维降解转化分析平台用于筛选降解效率提高的种质资源[60]。该平台可在16 h内研磨和称取1～5 mg的样品250份，并在后续的36 h内自动化完成预处理、酶解和产糖分析，非常适合于优异种质资源或突变体的大规模筛选。另外，他们开发了核心取样系统(CSD)，单人操作便可在8 h内完成1 000份以上样品的取样，取样均匀一致，无交叉污染，样品采集后可马上放入冰浴、干冰和液氮中保存[61]。该平台已接受来自全美细胞壁研究相关单位的样品(与美国能源部植物实验室DJ Walton教授的交流)。本课题组利用GLBRC高通量测定平台测定了水稻重组自交系中细胞壁半纤维素单糖组成、木质素含量和单体组成以及酶解转化效率，并定位QTL，探讨在能源植物改良中的应用。这些技术平台的开发无疑将大大加快细胞壁相关性状的数量遗传学研究进程。

3 细胞壁合成调控网络研究中的基因共表达分析

细胞壁的合成和代谢涉及大量基因，是一个精细的时空调控网络。科学家预测植物中有超过10%的基因直接参与细胞壁的代谢过程[62]。随着生物信息学以及大数据的发展，采用反向遗传学策略，通过生物信息学等手段筛选和预测相关基因，进行基因克隆和功能验证是目前细胞壁研究领域的主流。

3.1 表达谱与植物细胞壁研究

表达谱数据库提供基因对不同环境和处理的响应信息和在不同组织的时空表达情况。基因改变或者外界环境刺激，会引起相关代谢途径基因的协同改变。Gou等[63]研究了棉花纤维伸长过程中的基因表达谱和代谢变化。Guillaumie等[64]研究了在烟草中超量表达WRKY12 对木质素途径基因和木质部的发育影响。另外，表达模式相近的基因往往具有功能关联性，通过基因功能富集分析，可有效推断新基因功能[65-66]。此外，结合基因组的非编码序列分析可找出共表达基因共有的顺式作用元件，进而构建调控网络[67-68]。拟南芥中，从2005年起全基因组共表达分析开始被用来预测细胞壁基因网络[69-70]。Persson等[69]利用编码次生细胞壁纤维素合酶3个亚基的相关基因(AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8)为诱饵，鉴定了与之表达趋势一致的基因。共表达基因包括β-1,4内切葡聚糖酶基因、木质素合成相关基因(如PAL、COBRA-Like基因)以及与木聚糖等细胞壁等多聚物的合成糖基转移酶基因家族成员[71]。最近，Gu等[72]在拟南芥中利用共表达分析结合酵母双杂交成功筛选并验证了初生细胞壁的纤维素复合体相关基因CSI1，证明该方法对于发现次生细胞壁调控网络相关基因和蛋白质复合体组成基因都具有重要作用。

3.2 共表达分析在水稻细胞壁调控网络研究中的应用

在水稻中，大量积累的基因组数据为细胞壁合成调控网络研究提供了基础。水稻中目前有很多全基因组表达数据库可以利用，如CREP水稻全生育期基因表达芯片数据库涵盖了水稻整个生长发育的33个组织器官的表达信息[73]。Wang等[74]利用该数据库，首次在水稻细胞壁研究中进行基因共表达分析尝试。通过对水稻纤维素合酶超基因家族(OsCesA/CsL)和Cobra基因家族的表达模式分析，发现这些基因家族存在广泛的和功能相适应的共表达模块。如水稻初生细胞壁纤维素合酶的3个亚基基因(OsCesA1、OsCesA3、OsCesA8)密切共表达，次生细胞壁细胞壁纤维素合酶的3个亚基基因(OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9)密切共表达。随后，Xie等[75]也利用CREP数据库结合突变体分析对水稻纤维素酶相关基因开展了研究，发现纤维素酶相关基因中GH9A3和GHB5与初生细胞壁纤维素合酶基因(OsCesA1、OsCesA3、OsCesA8)共表达，预测参与细胞壁纤维素合成，而GH9B、GH9B1、GH9B16可能与纤维素的结晶度有关。Guo等[76]发展了一种加权基因共表达网络分析方法，结合CREP数据库进行系统的全基因组共表达分析，推测了与初生细胞壁、次生细胞壁合成和建构，半纤维素修饰和降解以及与木质素G 单体合成相关基因模块，并分析了模块间和模块内各基因相互关系，注释了基因的功能和代谢途径，初步建立了与水稻细胞壁合成调控相关的基因共表达网络。另外，中国科学院周奕华研究员课题组也通过对发育茎秆的转录组测序，正在筛选和验证次生壁合成调控的关键转录因子。通过基因的共表达分析，大规模的关键基因功能验证，有望最终揭示次生细胞壁合成调控机理。

4 展 望

细胞壁的合成调控机理复杂，涉及基因众多。细胞壁各成分含量、沉积方向、结晶度、聚合度的改变均能够影响细胞壁的理化特性。此外，植物为适应生长发育需要和多变的环境，细胞壁结构组成也动态可变，这就需要灵活多样的调控途径。以水稻为代表的禾本科植物细胞壁合成调控分子机制研究起步较晚，但已取得了长足进步，并表现以下的趋势。

茎秆突变体的发现为细胞壁研究作出了历史性贡献，至今仍在发挥作用。另外，新的研究手段也在不断丰富细胞壁研究的内容。在拟南芥中，2005年后开始采用综合研究策略研究细胞壁相关基因特别是对转录因子的研究。通过表达分析(如激光微切割技术分离不同细胞壁处于不同发育阶段的样品)，结合定量PCR和GUS染色，转录因子文库和酵母单双杂交以及遗传互补等手段，初步揭示了NAC、MYB、WRKY等转录因子参与拟南芥次生细胞壁合成的调控网络[77]。2015年，Taylor-Teeples等[78]系统阐述了从最关键的调控因子E2Fc出发，通过调控VND6、VND7等一系列转录因子，最终调控次生细胞壁基因表达的网络通路。目前，在禾本科模式植物水稻中DNA序列及基因组注释、基因芯片表达谱、蛋白质互作、转录因子、2D蛋白质数据、质谱、代谢网络等新类型数据库纷纷建立并偶联。显然，禾本科植物可以借鉴拟南芥的研究成果和策略。以生物信息学为出发点，综合应用各种手段研究细胞壁合成调控网络已经成为研究重点。

细胞壁高通量分析平台的建立克服了细胞壁性状数量遗传学研究的技术瓶颈，为大规模细胞壁性状测定和QTL定位带来了极大的便利。细胞壁QTL定位和数量遗传学的研究进展，将为分子标记辅助选择改良作物秸秆性状建立基础，但是精细定位克隆相关QTL尚待时日。

如果说化学分析技术平台的建立大大拓展了细胞壁研究的广度，那么核磁共振波谱技术(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)、原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)等技术的应用，将细胞壁结构的研究推进到分子和纳米水平。如利用 X-射线衍射技术，可以推测纤维素链结合模型，并区别疏水和亲水表面[79]。核磁共振波谱技术具有非破坏性、信息量大、可获得细胞壁天然结构信息的优点，已被广泛用于纤维素晶体结构、多糖结构与修饰及木质素结构分析。糖组学技术利用细胞壁多糖单克隆抗体和免疫组化技术, 可对各种类型细胞进行细胞壁组成原位分析。而糖抗体与酶联免疫吸附测定技术(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)结合发展出了新的类似芯片分析的技术，可快速、高通量获得细胞壁结构成分信息[80]。原子力显微镜达到纳米级的分辨率，可观察细胞壁自然形貌，可对纤维素晶体大小以及与半纤维素的相互作用进行观察和计算[81]。

近年来，已有一些相关的研究者报道了环境因子和激素对细胞壁合成调控的影响。水稻MYB103转录因子可调控细胞壁合成代谢[27-28]。细胞膜上的受体类激酶(RLK)既可作为一些信号分子的重要受体，又可将信号跨膜转移传递到细胞内，成为细胞壁信号通路的重要元件。最近，外界环境因子和激素(如赤霉素和油菜素内脂)参与细胞壁合成调控的报道逐年增多[28, 82-85]。如与赤霉素(GA)相关的DELLA蛋白可与正调控水稻纤维素合酶基因的转录因子NAC29/31互作，促进其降解从而抑制纤维素合酶基因的表达[84]。可以预期，与激素信号和外界环境刺激相关的植物细胞壁合成信号通路和基因网络将成为研究的热点。

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