花生茎线虫对花生根的趋向、定位及侵染特性

邓明雪, 肖　顺, 王文玉, 程　曦, 程　敏, 侯翔宇, 张绍升, 刘国坤

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

花生茎线虫(Ditylenchusarachis)是近年来在我国山东省、河北省花生产区发现的一种茎线虫新种，主要为害花生果荚、种皮[1]，是除非洲茎线虫(D.africanus)[2]外又一种可侵染花生并造成严重危害的茎线虫.花生植株受侵染后，主要表现为根系发育不良、稀疏，根瘤菌较少，结荚量低，果荚表面出现黑褐色腐烂斑，种皮变褐皱缩[1,3-4].花生茎线虫主要在遗落田间的病果荚或种皮上以脱水休眠的方式越冬，或以卵在病果荚或种皮上越冬[1]；第二年春季，土壤中越冬后的花生茎线虫或卵孵化后的幼虫，需迁移至寄主花生根系特定部位，并侵入根系进行取食和发育，种群扩大后再转移至土壤中，侵染花生扎入土壤中的果针、发育中的果荚，最后再转移至种皮进行为害.但目前花生茎线虫对花生根系的趋向、定位及侵染特性尚不明确，因此，本研究通过室内试验，利用Pluronic F-127胶体系统接种[5]及次氯酸钠—酸性品红染色法对此进行研究，为进一步开展防控工作提供理论依据.

1　材料与方法

1.1　供试线虫种群及培养

供试的花生茎线虫种群DCPXT为模式线虫，采自河北省刑台市花生果荚[1]，种群保存于福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室.将用于接种试验的花生茎线虫采用胡萝卜愈伤组织培养方法[3]培养30 d左右，线虫包含不同龄期，数量大.将愈伤组织稍剪碎，静置于无菌水中，1～2 h后线虫游出，采用改良贝尔曼漏斗法收集线虫，并离心浓缩，配制成适合浓度的花生茎线虫悬浮液，备用.

1.2　花生茎线虫对花生苗期根系的侵染

1.2.1供试花生品种及育苗供试的花生品种为冀油7号.取健康饱满花生种子，用0.3% NaOCl溶液消毒5 min，用无菌水充分淋洗3次以上，转移并均匀排列至装有适量无菌水的育苗盘上，育苗盘放在28 ℃培养箱中黑暗培养至露白.将经过180 ℃高温灭菌2 h的砂土(沙子∶壤土∶营养土=3∶1∶1)装入Ø=6 cm的纸杯中，将上述露白的种子种入其中，将纸杯集中放到托盘上，置于28 ℃培养箱中培养(光照∶黑暗=16 h∶8 h，光照度为66%).

1.2.2花生茎线虫的接种待纸杯中的花生真叶展开后，在花生植株根系周边用蓝色枪头戳6个1 cm左右深的小孔，用移液枪吸取1 mL花生茎线虫悬浮液(5 000条·mL-1),缓慢将线虫液均匀地接种到小孔中，最后把小孔轻轻盖平.接种后的培养条件同1.2.1.

1.2.3花生茎线虫对花生苗的侵染情况测定接种花生茎线虫后6、8、12、24、48、72、96、120 h依次从托盘中取出3株花生苗，用自来水轻轻冲洗掉根系表面杂质，利用改良次氯酸钠—酸性品红染色法对根系进行染色[6].根组织内线虫的观察以酸性甘油为浮载剂，在体视显微镜(Nikon SMZ18，含照相系统)下进行, 统计根系线虫的侵入量，观察线虫侵染和迁移情况.

1.3　花生茎线虫对花生离体根的侵染

1.3.1供试花生品种及育苗供试花生品种为冀油7号.消毒、淋洗方法同1.2.1，在育苗盘中催芽，待其萌发后，置于28 ℃光照培养箱中培养(光照∶黑暗=16 h∶8 h，光照度为66%)，至花生长出白色健壮长达1或5 cm左右的花生根系，备用.

1.3.2Pluronic F-127胶体配制采用Pluronic F-127三维胶系统[5,7]开展花生茎线虫对根的趋向试验.称取23 g Pluronic F-127(sigma, USA)颗粒溶解于80 mL 4 ℃预冷的无菌水中，置于4 ℃环境下24 h以上，使颗粒充分溶解，配制成100 mL 23% Pluronic F-127胶体(pH=7.0)，置于4 ℃冰箱中备用.这种胶体在低温条件(<15 ℃)下呈液态，而在较高的温度(>15 ℃)下则凝固成胶体状.

1.3.3花生茎线虫对花生根尖部位的趋向性测定采用爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)作为阳性对照.爪哇根结线虫种群在实验室的番茄(Solanumlycopersicum)根系上繁育.从番茄根系根结处挑取新鲜卵囊到无菌水中，28 ℃下黑暗孵育，每隔24 h收集一次新孵化的2龄幼虫(J2)，最后将线虫液离心浓缩，备用.

在10 ℃环境下，吸取Pluronic F-127胶体液3 mL于无菌的Ø=3.5 cm的一次性塑料培养皿中，并加入上述线虫浓缩悬浮液(花生茎线虫和爪哇根结线虫J2)，轻摇混匀，皿内最终线虫浓度为800条·mL-1.剪取新鲜的长1 cm的花生根系，平置于上述含有线虫的液态胶体中，每皿放置1条，用parafilm膜封住培养皿，转移至28 ℃黑暗培养箱中培养.花生茎线虫和爪哇根结线虫J2各设置25皿.培养0、3、6、9和12 h后，随机取出5皿，在Nikon SMZ18体视显微镜(含照相系统)下观察线虫趋向行为，拍照并统计1 cm长的根尖周边2 mm内聚集的线虫数目.培养24 h后取5条根系，利用改良次氯酸钠—酸性品红染色法进行染色，以酸性甘油为浮载剂，统计根系内线虫的侵入量.

1.3.4花生茎线虫对花生根定位及侵染特性测定10 ℃环境下，在Ø=7.5 cm的一次性无菌培养皿中加入10 mL Pluronic F-127胶体(含线虫800条·mL-1)，并加入花生茎线虫浓缩悬浮液.取长5 cm左右(带10条左右新侧根)的健康花生根，采用3种处理方式进行研究.处理1：将健康花生根平放入胶体中，每皿放1条花生根，目的是观测花生茎线虫对根的趋向部位.处理2：采用消毒的锋利刀片在健康花生根表面隔一定距离划一个微小伤口(深约200 μm)，每皿放1条花生根，目的是观测根表面微小伤口对花生茎线虫的吸引情况.处理3：采用消毒的锋利刀片横切花生根段，每段1 cm左右，形成切面伤口，每皿放5条花生根段，目的是观测根横切面伤口对花生茎线虫的吸引情况.将各处理根转移到28 ℃培养箱中黑暗培养.分别在胶体凝固后0、3、6、9和12 h，观察线虫对根的趋向部位，统计侧根基部及微小伤口、横切面伤口处的线虫数目；随后在每个处理中随机取5条根系(0 h除外)进行改良次氯酸钠—酸性品红染色，统计各处理部位侵入的线虫量.

1.4　数据分析

采用Excel软件对所有数据进行整理，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析.

2　结果与分析

2.1　花生茎线虫对花生幼苗根系的侵染特性

花生茎线虫盆栽接种6 h后，取花生根系进行染色，未发现线虫侵入；8 h后，在根系中可见少量线虫侵入薄壁组织，每条根平均线虫侵入量为7.8条；12、24、48、72 h侵染数量逐渐增多(每条根平均线虫侵入量分别为12.5、15.4、47.2、73.4条)；96 h时根内线虫侵入量为80.6条，且根内可见线虫卵，说明受精雌虫可侵入花生根系并在根内产卵(图1A，B)；120 h时根内线虫量达到高峰，平均达133.5条·根-1(图1C)，最多可达220条·根-1.在不同时期，根内均可见到不同龄期的幼虫或成虫，表明其幼、成虫均可侵染花生根系；在不同时期，花生根尖(含根冠1 cm左右)均未发现花生茎线虫，但在靠近茎基部处或与侧根生长相接的主根内线虫量较大.

A.接种后96 h的根；B.接种后96 h的根,含有线虫卵；C.接种后120 h的茎基部.图1　接种花生茎线虫后的盆栽花生根系(标尺=250 μm)Fig.1　Potted peanut roots after inoculation of D.arachis (scale bar=250 μm)

2.2　花生茎线虫对花生离体根的趋向、定位及侵染特性

2.2.1花生茎线虫对花生根尖的趋向性在Pluronic F-127胶体系统中，通过体视显微镜观察可知，在刚放入根尖时，线虫随机均匀地分散在胶体中，根尖周围线虫数量为9.84条；6、9、12 h观察的线虫数量分别为10.3、10.3、10.7条，无显著差异，也未见线虫向根尖游动聚集的现象(图2A-C).通过改良次氯酸钠—酸性品红染色法对花生根尖组织进行染色可见，在接种24 h后，只有极少数花生茎线虫在根冠表皮处被发现(图2D).这表明花生茎线虫对花生1 cm长的根尖无趋向性.

A-D.花生茎线虫；E-H.爪哇根结线虫J2.图2　Pluronic F-127胶体中花生茎线虫和爪哇根结线虫J2对花生根尖的趋向性(标尺=500 μm)Fig.2　Tropism of D.arachis and M.javanica J2 to peanut root tips in Pluronic F-127 gel (scale bar=500 μm)

阳性对照爪哇根结线虫J2对花生根尖具有明显的趋向性.0 h时，J2随机均匀地分散在胶体中，根尖周围线虫数量为10.2条；3 h后可看到J2以曲线运动方式向根尖分生区迁移(35.2条)；6 h时大量线虫聚集到根尖分生区(图2E)，线虫平均数量为60.3条；9 h时线虫聚集到分生区的数量达到顶峰，J2平均数量达到85条(图2F)，与其他时间的线虫数量存在显著差异(α=0.05)；12 h时根尖周围J2平均数量为62.5条(图2G)，数量降低可能与部分J2侵入根内有关.在观察过程中未见J2远离根尖游动的现象.每个时期根冠处吸引的线虫量不多(图2E-G).接种24 h后花生根尖组织染色表明，J2大量侵入根系中，聚集在根尖分生区与伸长区(图2H).

2.2.2花生茎线虫对花生根的定位及侵染特性在处理1中，花生茎线虫对花生根(5 cm，含新长出的侧根)的趋向部位与2.1和2.2.1试验结果一致.在接种12 h内，健康花生根尖对花生茎线虫没有吸引作用，周边线虫也没有向根尖游动的趋势；但是侧根基部对花生茎线虫具有明显吸引作用(图3A-C).在接种3、6 h时，侧根基部吸引的线虫量显著增大，到9、12 h时线虫总数稍下降(图4)，侧根基部的线虫聚集成团(图3A).通过对根系染色发现，侧根基部的主根处线虫量在12 h内呈现上升趋势(图5).线虫从侧根基部侵入后，在根内上下迁移(图3B，C)；但侧根基部以外的其他部位未见线虫侵入.这表明侧根基部是花生茎线虫在完整根段上最主要的侵入位点；前6 h线虫被大量吸引，后由于线虫侵入根内，侧根基部聚集的线虫量下降.

A.线虫在花生侧根基部聚集；B.侧根基部的主根组织内有线虫侵入；C.线虫从侧根基部侵入并上下迁移；D.线虫聚集于根表面的微伤口处；E、F.从花生根表面微伤口侵入的线虫在根内迁移；G.线虫聚集于根冠破损处但未向上迁移；H.根横切面伤口处有线虫聚集；I、J.从根横切面伤口处侵入的线虫数量少，而从侧根处侵入的线虫数量多.图3　花生茎线虫对花生侧根基部、人为微伤口、横切面伤口的趋向及侵染(A、F标尺=2000 μm，B-E、G-J标尺=500 μm)Fig.3　Tropism and infection of D.arachis to the lateral root base, artificial micro-wounds and transverse section wounds on peanut root (scale bar of A and F=2000 μm, scale bar of B-E, G-J=500 μm)

柱上不同小写字母表示同一部位在不同时间的线虫量在0.05水平上存在显著差异.图4　侧根基部、根系小伤口及切面伤口处花生茎线虫的数量Fig.4　Number of D.arachis on lateral root base and artificial micro-wounds and transverse section wounds on peanut root

在处理2中，接种3 h时发现线虫向微伤口移动，6 h时微伤口处的线虫量达到最高点，9、12 h时线虫总数稍下降，表明线虫已向根系侵入(图4).在根段微伤口处，可见大量线虫聚集，并呈侵入状态(图3D)；接种12 h后，根系染色可发现大量线虫已从微伤口侵入并上下迁移(图3E，F).这表明微伤口是花生茎线虫趋向并聚集侵染的部位.根冠区域如果没有伤口，未见线虫侵入(图3B)；但如果有小伤口，则可看到花生茎线虫聚集在根冠处，集中侵染于根冠内，但未见其在根内向上迁移(图3G).根内侵入的线虫量随着时间的延长不断增多，但在同一时间段低于侧根处侵入的线虫量(图5).

在处理3中，通过人为横切根造成大的切面伤口，观测发现切面伤口同样能吸引花生茎线虫聚集(图3H)，其聚集数量在12 h内随着时间的延长而上升；但在同一时间段，其聚集的数量显著小于侧根基部和微伤口处聚集的线虫数量(图4).通过染色观察发现，从切面伤口侵入的线虫量很少(图3I, J)，在同一时间段显著小于从侧根基部和微伤口侵入的线虫数量(图5).

3　讨论

线虫主要靠头部化感器感应植物根部或根际微生物所释放的水溶性或有气味的化学信号物质而趋向并定位寄主根部特定位置[7].植物的根系中含有许多化学物质，如氨基酸类、多糖类、蛋白质类、多种萜烯类和植物激素，都可能参与到对植物寄生线虫的吸引作用中，并且不同线虫的趋向物质存在差异[7].本研究发现，花生茎线虫对花生根系的趋向部位及侵染位点与爪哇根结线虫J2存在明显的差异.J2对根尖部位具有明显趋向性，其侵染位点位于根冠后部的细胞分生区或伸长区，这与内寄生定居型线虫2龄幼虫，如根结线虫(Meloidogynespp.)、孢囊线虫(Heteroderaspp.)侵入部位[8-12]一致；而花生茎线虫对花生根尖并无明显的趋性，对侧根基部或微伤口具有明显的趋向性.由于侧根起源于母根的中柱鞘，经分裂、分化形成生长点和根冠，侧根在突破母根时形成的挤压力会造成母根处形成微伤口[13]，花生茎线虫可能被微伤口处“泄漏”的植物组织分泌物所吸引，并从微伤口侵入.花生主根横切面大伤口虽对花生茎线虫有吸引作用，但线虫数量明显低于侧根基部及微伤口处的线虫数量.猜测完整细胞产生的化学物质通过微伤口释放到根表面来吸引花生茎线虫，而横切面伤口可能由于切口处细胞大量死亡，对线虫具有吸引作用的化学物质减少致使吸引效果不明显，切面死亡细胞也可能影响线虫的侵入.然而，花生茎线虫对花生侧根基部或微伤口的趋向是何种物质在起作用，尚需进一步研究.本研究还发现，在根冠样本处理过程中造成的小伤口也能吸引大量线虫侵入,但侵入根冠处的线虫并未向上部迁移，与从微伤口或侧根基部侵入的线虫在根内上下迁移存在明显的差异，这些机制均需进一步深入研究.

利用Pluronic F-127系统研究植物寄生线虫的化学趋向性，具有模拟土壤三维系统、三维空间观、热可逆、无毒等优点[5,7].植物寄生线虫在土壤中对根部的识别和定位除了与根系分泌物有关外，还可能涉及根际微生物所释放的化学物质.在Pluronic F-127胶体系统下只涉及根部分泌物因素，根际微生物是否发挥作用以及作用大小，无法通过该系统完成.研究过程中发现，利用Pluronic F-127胶体系统观察根系对线虫的吸引作用时，根系不宜太弱，并且试验时间不宜过长，因为这会造成根系失水变黄，影响试验结果.

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