高通量测序分析红棕紫泥土土壤细菌多样性

王 谢，张建华*，庞良玉，林超文，唐 甜，许文志，杨育林，向成华

(1. 四川省农业科学院土壤肥料研究所, 四川 成都 610066; 2. 四川省林业科学研究院, 四川 成都 610081 )

【研究意义】土壤微生物在农业生态系统中营养元素循环、有机物质的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生态环境改善、植物生长发育的调节、作物病虫害防治等方面起着极其重要的作用[1]。其中，土壤细菌是土壤微生物的重要组成部分，在土壤有机质分解、腐殖质形成、养分转化与吸收等过程中起到重要作用，其群落结构组成及其多样性变化是表征土壤环境质量的敏感指标[2]。红棕紫泥土为四川盆地丘陵区坡耕地主要的土壤类型，了解其土壤细菌群落结构，有助于了解区域土壤健康状况、和发挥土壤潜在的肥力和生态功能，为区域农林产品质量的提升和农田的可持续利用提供重要的参考依据。【前人研究进展】由于土壤微生物物种丰富、很多难以培养、且功能多样，利用传统的培养基培养、分离纯化得到的微生物种群仅占土壤整个微生物群落的1 %[3]。【本研究切入点】目前，第二代测序技术已经成为微生物群落结构研究的重要手段，利用高通量测序可检测到环境中大量的不可培养的微生物存在, Rosello等估计每克土壤约含有几千种微生物[4]。【拟解决的关键问题】本文以四川资阳土壤保护站坡耕地的红棕紫泥土为研究对象，利用16S扩增子高通量测序技术，对其土壤细菌群落构成和多样性进行研究，以期为未来进一步研究该地区土地利用方式与土壤生态功能调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

土壤样品于 2016年8月采集于四川省资阳市响水村(30°6’18.17” N，104°35’36.70”E， 405 m)，该地区地貌以丘陵地形为主，气候为亚热带季风气候类型，年平均气温17 ℃，年平均降水量874 mm，年无霜期约311 d。

1.2 样地设置

选择附近3个典型的丘体，分别标为S1、S2和S3。在连续1周晴天后，按照样线法[5]在其长期旱作的坡耕地上采集土壤样品，共设置样线 5条，用土芯取样器采集表层0～40 cm土壤。最后，根据丘体和样线进行编号，用四分法混合后取样带回。测序土样装入100 mL离心管中，-4 ℃下保存带回实验室待测。

试验土壤为侏罗纪遂宁组母质发育的红棕紫泥，长期种植模式为小麦套种玉米套种甘薯，土层厚40～60 cm，土壤层次分化不明显，测试土壤理化性质参见表1。

1.3 DNA提取及测序

准确称取0.1 g土样，采用MoBio试剂盒法，提取土样的总DNA。经1 %琼脂糖凝胶电泳测定DNA完整性、MiniDorp测定DNA纯度和浓度。每个样地的5份DNA样品随机取3份等量混匀，分别制成3个平行样本，于-20 ℃保存、备用。

参考Caporaso等[6]的方法，通过细菌16S rDNA V4区段引物来扩增各样品，其引物为515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。DNA扩增条件为98 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃延伸5 min[7]。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

1.4 数据分析和处理

将所测得原始序列截去Barcode序列和引物序列，利用FLASH(V1.2.7)[8]拼接获得原始Tags数据；利用Qiime(V1.7.0)[9]软件过滤处理原始Tags数据获得高质量的Tags数据，并与Gold database数据库进行比对，检测并去除其中的嵌合体序列[10]，获得有效数据。测序深度为每个文库原始reads数不少于4万条，以97 %相似性为依据，利用UPARS Epipeline软件将各序列聚类成为可执行的分类操作单位(Operational taxonomic units，OTUs)。

为获得土壤样品中微生物物种的多样性信息，用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1.0)，统计界、门、纲、目、科、属和种7个分类水平上的样本的群落组成。使用PyNAST(V1.2)软件与GreenGene数据库中的 "Core Set" 数据信息进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后使用Qiime(V1.7.0)软件计算土壤样本微生物群落α多样性的相关指数，用Chao1指数和ACD指数表征菌群丰度，用Shannon多样性指数和Simpson多样性指数表征菌群多样性。

2 结果与分析

2.1 检测到的可执行的分类操作单位

测序分析得到51 806～66 508条原始数据，其中有效序列占98.52 %～98.93 %，最小长度为44 bp，最大长度为389 bp，平均长度253 bp。有效数据进行聚类，得到4296个OUT。其中，细菌界的相对丰度为98.91 %，古菌界的相对丰富度为1.09 %。所检测到的细菌占所有分类物种的(11.39±1.64) %。

表1 供试土壤的化学性质

所有样品同时存在的有25个大的类群，分别是变形菌、拟杆菌、酸杆菌、厚壁菌、放线菌、芽单胞菌、疣微菌、浮霉菌、绿弯菌、蓝菌、单糖菌、硝化螺旋菌、奇古菌、装甲菌、绿菌、匿杆菌、JL-ETNP-Z39、衣原体、迷踪菌、热微菌、俭菌、TM6、食氢菌、螺旋体菌和纤维杆菌。此外，WCHB1-60、热袍菌、SHA-109、嗜热丝菌和同力菌存在于某两座丘体坡耕地土壤中，异常球菌-栖热菌、SM2F11、无壁菌、乌斯古菌、Candidate division OP3和暗黑菌仅存在于某一座丘体坡耕地土壤中。

2.2 门水平上的土壤细菌优势种群

在门水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为变形菌门(49.52 %±4.60 %)、酸杆菌门(11.55 %±3.01 %)、拟杆菌门(10.87 %±1.65 %)、放线菌门(6.12 %±1.58 %)、芽单胞菌门(5.42 %±2.00 %)、疣微菌门(3.75 %±0.93 %)、厚壁菌门(2.4 %±0.92 %)、浮霉菌门(2.29 %±0.78 %)、绿弯菌门(2.03 %±0.84 %)和奇古菌门(1.09 %±0.10 %)。

2.3 纲水平上的土壤细菌优势种群

在纲水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为β-变形菌纲(17.29 %±2.42 %)、γ-变形菌纲(13.16 %±2.42 %)、α-变形菌纲(11.92 %±2.78 %)、未鉴定的酸杆菌纲(10.04 %±2.89 %)、δ-变形菌纲(6.86 %±1.76 %)、鞘脂杆菌纲(5.59 %±1.15 %)、未鉴定的芽单胞菌纲(5.42±2.00 %)、纤维菌纲(4.07 %±0.48 %)、未鉴定的放线菌纲(4.03 %±1.42 %)和OPB35 soil group(2.29 %±0.57 %)。

2.4 目水平上的土壤细菌优势种群

在目水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为伯克氏菌目(12.75 %±2.44 %)、黄单胞菌目(10.76 %±1.00 %)、Subgroup 6(5.93 %±1.44 %)、鞘脂杆菌目(5.59 %±1.15 %)、鞘脂单胞菌目(4.55 %±0.63 %)、噬纤维菌目(4.05 %±0.47 %)、芽单胞菌目(3.92 %±1.24 %)、粘细菌目(3.83 %±0.73 %)、Subgroup 4(2.9 %±1.06 %)和根瘤菌目(2.78 %±0.83 %)。

2.5 科水平上的土壤细菌优势种群

在科水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为丛毛单胞菌科(8.99 %±2.44 %)、黄色单胞菌科 (8.33 %±0.79 %)、鞘脂单胞菌科(4.17 %±0.64 %)、Chitinophagaceae科(4.14 %±0.70 %)、芽单胞菌科(3.92 %±1.24 %)、噬纤维菌科(3.87 %±0.58 %)、草酸杆菌科(2.57 %±0.57 %)、亚硝化单胞菌科(1.55 %±0.35 %)、柄杆菌科(1.51 %±0.76 %)和RB41(1.40 %±0.50 %)。

2.6 属水平上的土壤细菌优势种群

在属水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为溶杆菌属(6.67 %±0.61 %)、鞘氨醇单胞菌属(3.37 %±0.20 %)、Flavisolibacter属(1.45 %±0.33 %)、马赛菌属(1.40 %±0.37 %)、Ohtaekwangia属(1.29 %±0.07 %)、Blastocatella属(1.12 %±0.46 %)、厌氧粘细菌属(1.01 %±0.47 %)、芽单胞菌属(0.97 %±0.34 %)、Pseudoduganella属(0.92 %±0.36 %)和波单胞菌属(0.84 %±0.53 %)。

2.7 种水平上的土壤细菌优势种群

在种水平上，相对丰富度排名前10的依次分别为变棕溶杆菌(0.82 %±0.98 %)、睾丸酮丛毛单胞菌(0.58 %±0.22 %)、厌氧性粘菌Fw109-5基因种(0.46 %±0.24 %)、日本硝化螺旋菌(0.36±0.15 %)、Steroidobacter菌WWH78基因种(0.36 %±0.05 %)、墨西哥假黄单胞菌(0.36 %±0.22 %)、Ellin517细菌(0.30 %±0.11 %)、莫氏根瘤菌(0.20 %±0.15 %)、疣微菌OR-59基因种(0.18 %±0.07 %)和纤维化纤维菌(0.17 %±0.10 %)。

2.8 土壤细菌群落α多样性

就局域均匀生境下土壤细菌的物种数目而言，红棕紫泥土中土壤细菌的物种组成复杂、多样。在菌群丰度上，Chao指数为(2738.54±83.04)种，ACE指数为(2743.72±73.80)种；在菌群的多样性上，Shannon多样性指数为9.05±0.06，Simpson多样性指数为0.99±0.0008。

3 讨 论

3.1 变形菌、酸杆菌、拟杆菌为红棕紫泥土优势类群

本研究发现红棕紫泥土中细菌以变形菌为主，约占所有细菌的50 %，其次为酸杆菌和拟杆菌，这三类型细菌占左右细菌的近70 %。该结果与其他一些土壤细菌多样性的研究结果相似，如朱英波等[11]指出变形菌和酸杆菌是黑龙江农田土壤细菌的优势菌群；韩晶等[12]指出变形菌和拟杆菌为博乐河入口湿地的优势菌群，两者约占总克隆的65 %；张建萍等[13]指出变形菌占宁夏地区稻田土壤细菌的比例最大(37.8 %), 其次为酸杆菌(16.2 %)、放线菌(12.2 %)和拟杆菌(10.8 %)。

3.2 变形菌的生态学功能

变形菌种类繁多且生态功能多样，对环境具有极强的适应性和变异性[14]。就本文中丰富度最高的丛毛单胞菌科和黄色单胞菌科细菌为例。丛毛单胞菌隶属变形菌β亚纲，这一类细菌对于酚类、喹啉类等污染物的降解很早就被研究人员发现，但由于遗传背景的差异性, 不同的丛毛单胞菌可降解的污染物及降解特性都有所不同[15]。黄色单胞菌科隶属变形菌γ亚纲，虽然是侵染叶片、诱发细菌性疫病的主要病原菌，但可用于农药降解[16]。

3.3 酸杆菌的生态学功能

酸杆菌是新近分出的一类细菌, 目前对它们研究还很少, 其在遗传和代谢上具有很高的多样性, 并在土壤等生态系统中具有重要作用[13, 17]。酸杆菌细菌一般具有嗜酸、寡营养、难培养的特点；但事实上并非如此，一些酸杆菌的基因序列也在中性、甚至碱性的环境中被检测出来[18]，本文的土壤环境也为碱性环境(pH≈8.8)。虽然现阶段酸杆菌在自然环境中的功能还知之甚少[18]，但有研究已经发现酸杆菌具有许多编码纤维素酶和半纤维素酶的基因[19]、部分菌种还具有异化铁还原能力[20-21]。

3.4 拟杆菌的生态学功能

拟杆菌在人畜肠道中的绝对数量优势，具有的突出的粪源指示作用[22]。在土壤中，拟杆菌主要参土壤有机质的分解[23]。张晓在研究林地恢复对土壤原核微生物群落结构的影响时也指出r策略细菌(变形菌门和拟杆菌门)的相对含量土壤碳净矿化率成正比[24]。

4 结 论

红棕紫泥土中土壤细菌的物种组成复杂、多样，第一优势细菌类群为变形菌，第二优势细菌类群为酸杆菌和拟杆菌。

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