不同水平豌豆蛋白粉对高邮鸭生长及其相关激素与基因表达的影响

周根来，杨晓志，殷洁鑫，周明夏，左伟勇

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.江苏省现代畜牧与新兽药工程技术中心，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300)

【研究意义】作为我国重要的食用豆类之一，豌豆提取得到的淀粉、纤维和蛋白不仅可以作为食品工业原料，也可以用在纺织、医药、化工等领域[1-2]。豌豆蛋白粉是豌豆加工粉丝后的副产品之一，具有营养价值较高、价格较低、资源较丰富等优势，可以作为非常规蛋白饲料部分替代鱼粉、豆粕等原料，其开发利用已逐渐得到重视。【前人研究进展】如何合理利用豌豆蛋白粉需要广泛深入的系统研究，但有关在猪、鸡饲粮中的研究鲜见，也没有在鸭饲粮中的研究报道。本团队前期研究表明豌豆蛋白粉可应用于高邮鸭饲粮中，使用6 %豌豆蛋白粉代替部分豆粕未影响0～4周龄高邮鸭的主要养分消化率，有助于消化器官的发育，并促进体内蛋白质和脂肪代谢。但其促生长的深层机制还未研究。【本研究切入点】本试验在0～4周龄高邮鸭饲粮中使用豌豆蛋白粉，研究其对鸭生长相关激素分泌及基因表达的影响。【拟解决的关键问题】为豌豆蛋白粉有效应用于鸭饲养实践中提供理论机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及日粮

试验选取160只1日龄体质健壮、体重接近的高邮鸭，随机分为4组，每组4个重复，每个重复10只鸭，公母各半。对照组(C0组)饲喂基础饲粮，参照NRC(1994)饲养标准以玉米—豆粕为基础进行配制；试验组(C1、C2、C3组)饲粮是在基础饲粮的基础上分别用3 %、6 %、9 %的豌豆蛋白粉代替豆粕配制而成，试验饲粮组成及营养水平见表1。试验期为28 d。试验鸭自由采食、充足饮水，按正常饲养程序进行免疫接种、光照和饲喂。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

注： 1)预混料为每千克饲粮提供: VA 15 000 IU，VD33200 IU，VE 12.5 IU，VK31.5 mg，VB14 mg，VB25 mg，VB62 mg，VB120.01 mg，生物素0.2 mg，叶酸0.5 mg，D-泛酸15 mg，烟酸65 mg，抗氧化剂100 mg，Fe (as ferrous sulfate) 86 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Zn (as zinc sulfate) 90 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg， I (as potassium iodide) 0.42 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。2)代谢能、氨基酸为计算值，其余为实测值。

Note: 1)The premix provided the following per kg of diets: VA 15 000 IU, VD33200 IU, VE 12.5 IU, VK31.5 mg, VB14 mg, VB25 mg, VB62 mg, VB120.01 mg, biotin 0.2 mg, folic acid 0.5 mg, D-pantothenic acid 15 mg, nicotinic acid 65 mg, antioxidant 100 mg, Fe (as ferrous sulfate) 86 mg, Cu (as copper sulfate) 8 mg, Zn (as zinc sulfate) 90 mg, Mn (as manganese sulfate) 80 mg, I (as potassium iodide) 0.42 mg, Se (as sodium selenite) 0.3 mg; 2) ME and AA were calculated values, while the others were measured values.

1.2 样品采集与处理

血清样品：28日龄时，每重复随机选取2只鸭进行翅静脉采血5 mL，静置30 min，在3000 r/min低温下离心10 min 取上清液装至冻存管中，于-20 ℃冰箱中保存备用。

肌肉组织样品：28日龄时，每重复随机选取1只鸭进行屠宰采样。试验鸭放血致死后，迅速采集每只鸭的胸肌和腿肌组织样本各1个，各肌肉组织样品立即放入液氮中速冻，实验室-70 ℃冰箱中保存备用。

1.3 试验方法

1.3.1 生长性能 在第1和28日龄时分别对各重复试验鸭群体进行空腹称重，用于计算各处理鸭的平均日增重ADG(g/d)。试验期间，记录每天每重复试验鸭的饲粮饲喂量，每1周统计每重复的剩料量，计算各处理鸭的平均日采食量ADFI(g/d)。根据每重复试验鸭的ADG和ADFI计算各处理鸭的料重比(F/G)。记录鸭只死亡体重，以校正鸭只的耗料及其他指标。

1.3.2 血清激素水平测定 鸭血清样品中生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因-1(IGF-1)和瘦素(Leptin)水平采用放射性免疫法测定，测定所用试剂盒购自上海沪宇生物科技有限公司。

1.3.3 引物设计与合成 根据NCBI公布的禽类GH1(101790997)、Insulin(101794427)、IGF-I(101793597)、Obese(AY555727.1)和β-actin(101800437)的基因序列，采用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物序列见表2。

1.3.4 RNA提取与反转录 采用Trizol法提取鸭胸肌和腿肌组织中的总RNA。用分光光度计测定OD260/OD280的比值以检测RNA的纯度，再用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-70 ℃保存备用。反转录体系为20 μl：10 μl 2×RT buffer，1 μl 6N 随机引物(100 pmol/μl)，1μl RT-mix，5 μl RNA模板，3 μl DEPC水。反应孵化条件为25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，反应结束后短暂离心，-20 ℃保存备用。

1.3.5 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR反应体系50 μl：cDNA 2 μl，上、下游引物(25 pmol/μl)各1 μl，2×PCR buffer 25 μl，Sybr green I 0.5 μl，DEPC水20.5 μl。反应程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环35次，72 ℃检测信号。每个样品3个重复的检测，以内参基因β-actin作对照，记录各样品的Ct值。

1.4 数据分析

实时荧光定量结果采用2-ΔΔCt法表示试验组目的基因的相对表达量[3]，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，△△Ct=△Ct(试验组)-△Ct(对照组)。应用SPSS 16.0统计软件分析各组数据，采用One-way ANOVA方差分析，LSD法进行多重比较。各处理结果用平均值(mean)±标准差(SD)表示。

2 结果与分析

2.1 鸭生长性能的比较

豌豆蛋白粉对鸭日增重、日采食量和料重比的影响见表3，C1和C3平均日增重极显著低于C0(P<0.01)，C2日增重显著低于C0(P<0.05)，其中C3比C0要低23.22 %。3个试验组的平均日采食量随豌豆蛋白粉添加比例的增加呈下降趋势，C1和C3都极显著低于C0(P<0.01)，C2显著低于C0(P<0.05)，其中C3采食量降低最多，比C0低24.57 %。C2和C3料重比要低于C0，但差异不显著(P>0.05)，C1的料重比相对于C0高0.22，且差异显著(P<0.05)。

表2 目的基因及β-actin的引物序列

表3 豌豆蛋白粉对鸭生长性能的影响

注: 相同指标，不同大小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。下同。

Note: In the same line, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels．The same as below.

表4 豌豆蛋白粉对鸭血清激素水平的影响

2.2 鸭血清激素水平的比较

豌豆蛋白粉对4周龄高邮鸭血清激素水平的影响见表4。C2、C3的胰岛素样生长因子-I IGF-I水平显著高于试验组C1(P<0.05)，同时也高于C0但差异不显著(P>0.05)。豌豆蛋白粉对生长激素GH、胰岛素Insulin和瘦素Leptin3种激素水平的影响不显著，各试验组之间、以及与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。

2.3 鸭生长相关基因表达量的比较

豌豆蛋白粉对4周龄高邮鸭胸肌、腿肌中生长基因GH、肥胖基因Obese、胰岛素基因Insulin和 胰岛素样生长因子基因IGF-I4种与生长发育相关基因mRNA表达量的影响分别见图1～2。

相同基因不同处理不同大小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。下同In the same gene, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels. The same as below图1 豌豆蛋白粉对鸭胸肌中生长相关基因表达的影响Fig.1 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the breast muscles of ducks

试验组腿肌中GH表达量均不同程度高于对照组，但差异不显著(P>0.05)；试验组胸肌中GH表达量与C0差异不显著，C2胸肌GH表达量最高，达到C0的1.5倍，同时极显著高于C1(P<0.01)。C2和C3胸肌中Obese表达量要高于C0，但差异不显著(P>0.05)；试验组腿肌中Obese表达量也高于C0，其中C2组要显著高于C0(P<0.05)。试验组胸肌和腿肌中Insulin表达量(除C1组腿肌)均不同程度地高于C0，但差异不显著(P>0.05)。C2、C3组胸肌和腿肌中IGF-I表达量均高于对C0组，但胸肌中差异不显著(P>0.05)，腿肌中C2表达量要显著高于C0(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 对鸭生长性能的影响

豌豆蛋白粉作为非常规饲料资源，其各种营养成分含量接近于大豆粕，可用作植物性蛋白质饲料。但与其他饲料相比，豌豆蛋白粉含有抗原蛋白、凝集素等抗营养因子，同时含有多酚类物质，具有一定的苦涩味，影响其适口性[4-5]。本试验结果表明，豌豆蛋白粉替代豆粕降低了鸭的平均日增重和日采食量，这是由于豌豆蛋白粉抗营养因子和适口性的影响，特别是其添加比例为9 %时下降最明显。李金喜在肉鸡生产中的应用研究表明豌豆蛋白粉的使用降低了试验鸡的增重和采食量，但对料重比没有显著影响[6]，这也与本试验研究基本一致。各试验鸭的料重比除了3 %组显著高于豆粕组，其余试验组与豆粕组差异不显著，结合增重和采食量2个指标，表明在3种豌豆蛋白粉使用量中添加6 %豌豆蛋白粉时鸭的养分利用效率最高。使用豌豆蛋白粉明显降低了畜禽采食量和日增重两个重要的生长性能指标，但考虑到豌豆为非转基因食品和非过敏源、豌豆蛋白粉价格对于豆粕，加之试验表明6 %豌豆蛋白粉组的料重比要高于豆粕组，因此豌豆蛋白粉替代豆粕后可以保障动物产品安全、降低饲养成本。

图2 豌豆蛋白粉对鸭腿肌中生长相关基因表达的影响Fig.2 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the leg muscles of ducks

3.2 对鸭生长相关激素分泌及基因表达的影响

畜禽生长发育是一个极其复杂的生理过程，受到品种、营养、环境、饲养管理及动物疾病等多个因素的影响和控制。其中，营养等外在因素会通过调节神经内分泌激素的水平而影响畜禽生长，也会调控机体的基因表达量以影响畜禽的生长代谢。

生长激素(growth hormone, GH)位于“下丘脑—垂体—靶器官”生长轴的中心环节，是由脑垂体前叶合成和分泌的一种蛋白质激素。生长激素具有促进动物肌肉和骨骼等组织生长、调节机体新陈代谢、促进蛋白质合成和脂肪分解的生理功能。有研究表明，垂体中GH合成与血液中GH含量随相对生长率的下降而降低，GH水平与禽类相对生长速度呈正相关，对促生长有积极意义[7]。本试验结果显示，使用豌豆蛋白粉或豆粕后GH分泌没有差异，表明豌豆蛋白粉不影响鸭的GH分泌。GH基因是一种重要的与生长发育相关的功能基因。已有研究通过基因敲除、转基因等技术验证了GH基因与畜禽生长和生产性能有关[8]。本研究表明，豌豆蛋白粉的使用对鸭肌肉中GH基因的表达没有影响，但添加6 %的豌豆蛋白粉后鸭胸肌中GH表达量达豆粕组的1.5倍。这一结果提示适当使用豌豆蛋白粉具有促进鸭生长发育的潜力。GH发挥生理作用主要通过两种方式：一是作用于肝脏等靶器官，通过结合GH受体介导产生IGF-I，IGF-I再以内分泌方式进入血液，与结合蛋白结合后到达靶器官，作用于胰岛素样生长因子受体，从而调节畜禽生长发育；二是直接作用于靶器官的GH受体，通过旁分泌或自分泌IGF-I来直接影响细胞的代谢或调节组织器官的发育，从而调节生长发育[9-10]。胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I, IGF-I)与GH同为调控畜禽生长发育的重要因子，可由肝脏、肌肉等多个组织产生，从而发挥自分泌、旁分泌作用[11]。研究表明，IGF-I具有促进组织细胞的发育、增殖和分化的作用，以促进畜禽的生长发育[12]。本研究发现6 %豌豆蛋白粉可显著提高鸭腿肌中IGF-ImRNA表达量，提示鸭体内GH主要通过第二种方式直接作用于肌肉组织，介导IGF-I的分泌以促进鸭生长发育。

胰岛素(Insulin)是由胰腺分泌的一类代谢调控的激素，具有促进糖原、蛋白质和脂肪合成的作用。作为调节糖代谢最重要的激素，能降低畜禽体内血糖水平。本研究结果显示，豌豆蛋白粉使用后对鸭Insulin激素水平和肌肉基因表达量没有影响，这也进一步验证了之前研究中豌豆蛋白粉对鸭血清葡萄糖水平没有影响的结论。瘦素(Leptin)作为肥胖基因(Obese)的表达产物，是由脂肪组织特异分泌的蛋白类激素，可传递信号给下丘脑以调控畜禽摄食行为和机体能量代谢、减少体内脂肪蓄积[13]。本研究结果表明，使用6 %豌豆蛋白粉的鸭腿肌中Obese表达量显著高于豆粕组的鸭，这也从分子层面解释了前期研究中6 %豌豆蛋白粉鸭血清甘油三酯水平提高以降低脂肪组织沉积的原因。

4 小 结

使用豌豆蛋白粉替代豆粕影响到高邮鸭的平均日增重和日采食量，但6 %豌豆蛋白粉组的料重比显著低于豆粕组，表明其养分利用率最高。使用豌豆蛋白粉对高邮鸭血清中GH、Insulin、Leptin、IGF-I4种激素的水平没有显著影响。使用豌豆蛋白粉对高邮鸭肌肉中Insulin表达没有显著影响，GH、IGF-I和Obese3个基因的表达普遍上调。试验组中6 %豌豆蛋白粉基因表达成绩最佳，该组GH表达量最高，腿肌中IGF-I和Obese的表达量显著高于对照组，可部分揭示其促生长的分子机制。

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