单宁酸通过抑制TRAF6向细胞质膜的招募抑制Akt信号通路

阮海华，胡双艳，张春晨，曹 婳，张 真

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称Akt）信号通路是生物体内一条非常重要的生存信号通路[1-2]。EGFR主要是通过二聚化后刺激Ras蛋白，导致磷酸化级联反应激活Akt信号通路，故有学者将其称为EGFR/Akt信号传导通路[3]。EGFR/Akt信号传导通路在实体肿瘤，如黑色素瘤、肝癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和白血病中发挥重要的作用，促进细胞侵袭迁移、加速细胞周期进程、促进细胞增殖[4]。明确该信号通路在肿瘤细胞中的作用机制，寻找阻断该信号通路的靶向药物是国内外的研究热点之一。

植物多酚是来源于植物的次级代谢产物，大量的研究表明植物多酚具有抗突变[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗菌[8]等生物学活性。单宁酸属于易溶于水的植物多酚类化合物，在红葡萄酒、茶叶、水果中均含量较多[9]。最新的研究发现，单宁酸能够作用于乳腺癌细胞EGFR，诱导乳腺癌细胞发生凋亡[10]。在本实验室前期研究中，通过检测EGFR全酪氨酸位点的磷酸化发现，单宁酸处理显著抑制了由表皮生长因子诱导的EGFR的磷酸化，而且具有位点特异性。例如，单宁酸能够抑制EGFR Y1068和Y1045的磷酸化，进而抑制受这些特异位点磷酸化调控的信号传导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，阻断受STAT3信号通路调控的基因表达，促进细胞凋亡。实际中众多研究表明，肿瘤的发生与发展是多因素、多基因、多途径的结果。除了STAT3信号通路，在大部分人恶性胶质瘤细胞以及头颈癌细胞中，EGFR/Akt信号通路均存在不同程度的失调。然而，单宁酸对EGFR/Akt信号通路的调节作用仍不清楚。本研究发现单宁酸抑制EGFR的磷酸化，改变肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis receptor-associated factor 6，TRAF6）蛋白的亚细胞定位，而TRAF6亚细胞定位的改变介导了单宁酸对Akt信号通路的调控，抑制人胶质瘤U87细胞的增殖。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

人胶质瘤U87细胞由东京大学医学院Jun-Ichiro Inoue教授提供。

单宁酸（CAS号1401-55-4，相对分子质量为1 701.20） 美国Sigma-Aldrich公司；Gibco胎牛血清、Protein A/G免疫沉淀磁珠 美国Thermo Fisher Scientific公司；HyClone™ DMEM高糖培养基 美国GE Healthcare公司；磷酸化EGFR（Tyr1068）抗体、EGFR抗体、磷酸化Akt（S473）抗体、Akt抗体（鼠源）、TRAF6抗体（鼠源）、磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic translation initiation fator 4E-binding protein 1，4EBP-1）抗体、磷酸化S6抗体 美国Cell Signaling Technology公司；微管蛋白、小窝蛋白1、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联二抗 美国Santa Cruz Technology公司；TRAF6抗体（兔源）、Akt（兔源） 美国Millipore公司；电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒、VigoFect转染试剂 威格拉斯生物技术（北京）有限公司；3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS）细胞增殖试剂盒（G3850） 美国Promega公司。

pcDNA3质粒由西南大学李洪涛博士惠赠；编码EGFR vIII突变体的基因序列为从EGFR cDNA序列（GenBank：BC094761.1）中去除编码第2～7位外显子间，即去除第241～870位核苷酸的序列。进行全基因合成后，克隆至pcDNA3质粒中。

其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

细胞培养皿 美国Corning公司；HERACELL 150i CO2培养箱 美国Thermo Fisher公司；SpectraMax M5多功能读板机 美国Molecular Device公司；Trans-Blot SD半干转印槽、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；Alpha Imager Mini凝胶成像系统 美国Protein Simple公司；5430R小型台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人胶质瘤U87细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基（完全培养基）中，并置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，以质量分数0.25%胰蛋白酶消化传代。当单层细胞融合度达到70%～80%时进行单宁酸处理。处理培养基为完全培养基内含80 μmol/L单宁酸，每组3 个复孔，培养24、48、72 h后，用细胞刮刀刮取细胞，并收集至离心管中。

1.3.2 MTS法检测单宁酸对U87细胞增殖的影响

U87细胞以6×104个/mL的浓度接种于96 孔板内，每孔100 μL培养基。24 h后弃培养基，分别加入100 μL含80 μmol/L单宁酸的完全培养基，培养24、48、72 h，每组3 个复孔。采用MTS细胞增殖试剂盒测定OD490nm值。

1.3.3 蛋白质印记法检测U87细胞蛋白质的表达和磷酸化

均采用蛋白质印记法。细胞处理方法同1.3.1节，收集细胞，参照文献[11]制备蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后转膜，用5%脱脂乳粉封闭。将一抗按照体积比1∶1 000稀释后于4 ℃孵育过夜。以TBST（tris buffered saline with Tween）溶液洗涤3 次后加入体积比1∶2 000稀释的二抗，室温孵育1 h。采用ECL化学发光试剂显影曝光后洗X光片，利用Alpha Imager Mini凝胶成像系统测定条带的灰度值，利用灰度值表征条带的强度。

1.3.4 免疫共沉淀

收集单宁酸处理后细胞，利用裂解缓冲液（50 mmol/L Tris溶液（pH 7.6）、1 mol/L NaCl、1% NP-40、0.5% Triton X-100、5%脱氧胆酸钠、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂Cocktail）按照干细胞与裂解液1∶3的比例加入裂解液。冰浴30 min，用匀浆器反复匀浆100 次。于15 000×g低温离心30 min，收集上清液，在上清液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于4 ℃混悬30 min。将混悬液置于磁力收集器上，弃沉淀，收集上清液。将上清液中加入兔源抗TRAF6抗体于4 ℃混悬过夜，次日在混悬液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于室温混悬1 h，收集Protein A/G 免疫沉淀磁珠沉淀，并用10 倍体积裂解液反复润洗沉淀3 次，用SDS-PAGE 1×上样缓冲液溶解沉淀Protein A/G免疫沉淀磁珠后，进行抗鼠源TRAF6以及抗鼠源Akt的蛋白质印迹检测。以全细胞裂解液（whole cell lysate，WCE）作为上样参照，微管蛋白作为内参。

1.3.5 细胞转染实验

人胶质瘤U87细胞培养至2×106个/10 cm2细胞培养板的密度后，按照Vigofect转染试剂说明书进行转染。转染24 h后进行单宁酸处理后收集细胞，进行免疫共沉淀以及蛋白质印迹分析。

1.3.6 细胞亚组分分离

单宁酸处理人胶质瘤U87细胞后，细胞亚组分分离参照文献[12]的方法。利用超速离心机于80 000×g低温离心2 h后，上清液部分即为细胞胞浆组分；将收集的沉淀继续用10 倍体积缓冲液重悬后，再次利用超速离心机进行上述操作，获得的沉淀部分即为质膜部分。

1.4 数据处理

采用SPSS V18.0软件进行单因素方差分析，同时通过Student’s t检验进行组间比较，以P＜0.05为差异显著。所有实验结果至少重复3 次，用 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 单宁酸处理抑制人胶质瘤U87细胞的增殖

通过MTS细胞增殖检测试剂盒研究单宁酸对人胶质瘤U87细胞增殖的影响，结果如图1所示。

图1 单宁酸处理对人胶质瘤U87细胞增殖活性的影响Fig. 1 Effect of tannic acid on the proliferation of human glioma U87 cells

由图1可知，与对照组细胞相比，80 μmol/L单宁酸处理24 h显著抑制人胶质瘤U87细胞的增殖（P＜0.05），并且细胞增殖抑制率随着单宁酸处理时间的延长（48～72 h）而升高。80 μmol/L单宁酸处理48、72 h后，发生细胞死亡的比率分别达到27.9%和45.8%，这与Darvin等[10]发现单宁酸能够抑制乳腺癌细胞增殖的结果相类似。实验结果表明，单宁酸能够显著抑制人胶质瘤细胞的增殖，抗肿瘤效果显著。

2.2 单宁酸抑制人胶质瘤U87细胞Akt信号通路的磷酸化

为了进一步研究单宁酸对EGFR/Akt信号通路的影响，用80 μmol/L单宁酸处理人胶质瘤U87细胞，并检测Akt的磷酸化情况。由图2可知，80 μmol/L单宁酸处理对Akt蛋白的整体表达未见明显影响，但显著抑制了Akt丝氨酸473位点的磷酸化（pS473）。一般来讲，磷酸化激活的Akt可磷酸化激活其下游2 个效应蛋白靶点：4EBP-1[13]和核糖体S6蛋白[14]的磷酸化。其中，4EBP-1蛋白在不同信号因子的刺激下（例如紫外照射、生长因子、胰岛素等）被磷酸化激活而从4EBP上分离下来，结合并促进帽结构依赖性（cap-dependent）mRNA翻译蛋白的起始[15]；核糖体S6蛋白被磷酸化后，促进5’ TOP（5’terminal oligopyrimidine tract）mRNA翻译蛋白的起始，进而促进翻译起始和许多翻译元件成分如核糖体蛋白、延伸因子等的翻译，促进肿瘤细胞增殖[16]。通过检测单宁酸对4EBP-1以及核糖体S6蛋白磷酸化的影响发现，与单宁酸抑制Akt pS473的结果相一致，单宁酸显著抑制了4EBP-1丝氨酸65（Ser65）位点的磷酸化以及核糖体S6蛋白丝氨酸235和236（Ser235/236）位点的磷酸化。利用凝胶成像系统对Akt pS473的条带进行灰度扫描，结果如图3所示。

图2 单宁酸处理对人胶质瘤U87细胞Akt及其下游效应蛋白磷酸化的影响Fig. 2 Effect of tannic acid on the phosphorylation of Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells

图3 Western blot灰度扫描定量分析单宁酸对人胶质瘤U87细胞Akt及其下游效应蛋白磷酸化水平的影响Fig. 3 Quantitative analysis of tannic acid on phosphorylated Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells by Western blot

由图3可知，以对照组设定值为100%，发现80 μmol/L单宁酸处理24 h后，对Akt pS473的抑制率达到25.3%；而处理48 h后，抑制率接近50%。通过蛋白条带灰度扫描计算抑制率发现，当处理72 h时，单宁酸对4EBP-1蛋白pSer65的抑制率达到88.4%，对核糖体S6蛋白pSer235/236的抑制率达到74.7%。综上所述，表明单宁酸处理抑制Akt信号分子的磷酸化，并抑制了受Akt信号通路调控的4EBP-1和核糖体S6蛋白的磷酸化，抑制蛋白质的翻译合成，诱导人恶性胶质瘤U87细胞凋亡。

2.3 单宁酸处理抑制TRAF6与Akt蛋白间的相互作用

图4 单宁酸对人胶质瘤U87细胞Akt与TRAF6间相互作用的影响Fig. 4 Effect of tannic acid on interaction between Akt and TRAF6 in human glioma U87 cells

TRAF6是细胞中介导EGFR/Akt信号通路的重要中间分子，EGFR的过度激活能够招募TRAF6至细胞膜，TRAF6与Akt结合并通过其自身的RING型泛素连接酶活性催化Akt的泛素化修饰，进而介导泛素依赖的Akt磷酸化激活[17]。基于此，本研究利用TRAF6抗体免疫沉淀TRAF6蛋白，分析单宁酸对TRAF6和Akt间相互作用的影响。由图4可知，在沉淀的TRAF6蛋白中成功检测到Akt蛋白，然而与对照组相比，经单宁酸处理的细胞中与TRAF6共沉淀的Akt蛋白的数量明显减少。实验结果表明，经单宁酸处理后，细胞中与TRAF6结合的Akt蛋白明显减少，进而导致依赖TRAF6的Akt磷酸化受到抑制。综上所述，表明单宁酸对Akt信号通路的抑制作用是通过TRAF6的介导实现的。

2.4 单宁酸抑制TRAF6向细胞质膜的招募

由于TRAF6介导的Akt磷酸化主要发生在细胞质膜[17]，为了研究TRAF6的作用机制，本研究检测了单宁酸对TRAF6亚细胞定位的影响。由图5、6可知，单宁酸对人恶性胶质瘤U87细胞胞浆中TRAF6蛋白量影响不大，却显著减少了细胞质膜上的TRAF6蛋白的数量。通过蛋白条带灰度扫描发现，单宁酸处理24、48、72 h后，质膜上TRAF6蛋白分别减少了43.7%、50.0%和76.7%。实验结果表明，单宁酸处理抑制TRAF6蛋白向细胞质膜的招募。结合图4中单宁酸减少了与TRAF6互作的Akt蛋白的数量，可推测单宁酸通过降低TRAF6向细胞质膜的招募导致与TRAF6结合的Akt蛋白减少，进而抑制Akt的磷酸化。

图5 单宁酸对人胶质瘤U87细胞TRAF6亚细胞定位的影响Fig. 5 Effect of tannic acid on the subcellular localization of TRAF6 in human glioma U87 cells

图6 Western blot灰度扫描定量分析单宁酸对人胶质瘤U87细胞TRAF6亚细胞定位的影响Fig. 6 Quantitative analysis of tannic acid on TRAF6 subcellular localization in human glioma U87 cells by Western blot

2.5 单宁酸抑制TRAF6向细胞质膜的招募与EGFR的磷酸化的相关性

EGFR是一种糖蛋白，主要由3 个部分组成：第一部分是胞外配体结合结构域，包括N端621 个氨基酸残基，这些残基富含半胱氨酸，并形成多对二硫键，其上结合有糖基，是表皮生长因子结合的位点；第二部分是跨膜结构域，由23 个氨基酸残基组成；第三部分是胞内激酶结构域，由542 个氨基酸残基组成，含有酪氨酸激酶和几个酪氨酸磷酸化的位点[18]。为了研究单宁酸调控TRAF6质膜招募是否与EGFR的磷酸化有关，在人胶质瘤U87细胞中表达EGFR组成型激活突变体EGFR vIII。EGFR vIII突变体中编码EGFR胞外区的第2～7位间外显子丢失，导致EGFR蛋白胞外配体响应区缺失，形成分子质量为155 kDa左右的突变蛋白[19]。与野生型EGFR的激活受胞外配体，例如表皮生长因子（epidernal growth factor，EGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等的激活不同，EGFR vIII能够在没有配体存在的条件下组成型激活[20]。因此，在人胶质瘤U87细胞中利用pcDNA3质粒载体异位表达EGFR vIII突变体，转染24 h后检测EGFRvⅢ突变体的磷酸化，结果如图7所示。

图7 单宁酸对过表达EGFRvⅢ突变体细胞中TRAF6细胞质膜招募的影响Fig. 7 Effect of tannic acid on TRAF6 recruitment to plasma membrane after ectopic expression of EGFRv III mutant in human glioma U87 cells

由图7可知，利用EGFR抗体成功检测到EGFR vⅢ突变体蛋白的表达，其分子质量略小于野生型EGFR蛋白的分子质量。进一步检测EGFR的磷酸化（Y1068）发现在没有任何配体（EGF）存在的条件下，检测到EGFR vⅢ突变体的组成型激活。但是，与对照组相比，单宁酸处理48 h后虽然对野生型EGFR的磷酸化有抑制作用，但是对EGFR vIII突变体的磷酸化未表现抑制作用。实验结果表明，单宁酸对EGFR磷酸化的抑制作用需要EGFR胞外区第2～7位外显子间的区域，该区域的丢失导致EGFR的磷酸化对单宁酸不敏感，该区域是单宁酸调控EGFR的关键区。同时，在EGFR vIII突变体过表达的细胞中，Akt和TRAF6招募至细胞质膜上的数量未受到单宁酸的影响，即EGFR vIII磷酸化激活不受单宁酸影响后，招募至细胞质膜上TRAF6和Akt的数量也不受单宁酸影响，表明单宁酸通过调控EGFR磷酸化抑制TRAF6向细胞质膜的招募，而质膜TRAF6的减少介导了Akt磷酸化信号的抑制，诱导细胞发生凋亡。综上所述，EGFR可能是单宁酸的受体，单宁酸通过EGFR实现跨膜信号传递，调控肿瘤细胞的增殖和细胞周期，诱导肿瘤细胞发生凋亡，发挥抗肿瘤功效。

3 讨 论

TRAF6是肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor，TNF）和Toll样/白细胞介素-1受体（Toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接头分子[21]，在天然免疫和获得性免疫中发挥多重的作用[22]。同时TRAF6是细胞中介导EGFR/Akt信号通路的重要中间分子[17]。TRAF6具有泛素连接酶活性[23]，其可泛素化修饰Akt进而介导泛素途径依赖的Akt磷酸化激活[24]。TRAF6通常作为一个开关，决定在细胞内开启何种信号[17]。本研究结果表明，细胞经单宁酸处理后，招募至质膜上的TRAF6蛋白减少，进而介导了单宁酸对EGFR/Akt信号通路的抑制作用，抑制肿瘤细胞的增殖。其中，质膜招募TRAF6蛋白的减少可以通过两个方面抑制Akt的磷酸化激活：一方面与TRAF6直接相互作用的Akt蛋白数量减少，该推论已经被图4的结果证实，导致Akt磷酸化被抑制；另一方面，TRAF6是激活转化生长因子激酶1（transform growth factor kinase，TAK1）的关键蛋白[25]，例如，转化生长因子（transform growth factor，TGF）通过TRAF6激活TAK1[26]，而TAK1是磷酸化Akt的蛋白激酶[27]。因此，单宁酸抑制质膜TRAF6的招募，进而抑制TAK1的激活，导致Akt磷酸化抑制的可能性也不能排除。

单宁酸对EGFR磷酸化的调节作用依赖于EGFR胞外区第2～7位外显子所在片段，即从第81～290位氨基酸残基间的片段，该片段恰好为EGF结合区[19]，推测单宁酸可能通过和EGF竞争与EGFR结合，发挥其抗肿瘤作用。另外，单宁酸与EGFR结合后，可能诱导EGFR或其二聚体发生特定的构象变化，使部分位点的磷酸化受到空间限制，不易于发生磷酸化激活，但对有的位点影响不大，其原因还需要进一步深入研究。因为单宁酸属于植物多酚类物质[28]，分子质量偏大，易溶于水，其化学结构导致单宁酸很难穿过细胞膜进入细胞内部，因此，单宁酸通过作用于EGFR胞外区，抑制肿瘤细胞中异常激活的EGFR磷酸化，进而实现单宁酸信号的跨膜传递。已有研究发现，EGFR是单宁酸的受体蛋白[10]，单宁酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用主要通过调控EGFR进行，而EGFR的磷酸化位点有多个，每个位点的磷酸化都与相应的信号转导通路相偶联[29]。本实验室前期研究中发现单宁酸对Janus激酶（Janus kinase，Jak）/STAT3信号通路也存在抑制作用。结合本研究中单宁酸通过抑制TRAF6向质膜招募抑制EGFR/Akt信号通路，推测单宁酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用与EGFR的功能类似，可能存在多条信号通路的共同作用。是否除了这2 条信号通路，单宁酸对其他信号转导途径，例如丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）以及核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号途径，是否存在调控作用还需要进一步研究。进一步比较不同信号通路在单宁酸抑制肿瘤细胞增殖中的作用对于阐述单宁酸的功能是非常重要的。

综上所述，食品中的单宁酸能够通过TRAF6介导抑制肿瘤细胞中过度激活的EGFR/Akt信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖，为新型抗癌食品甚至药物的开发提供了理论基础。这与很多研究人员利用TRAF6作为靶点开发新的对抗晚期癌症的策略相类似，例如乳腺癌和前列腺癌[30]，为富含单宁的食物或者在药物中添加单宁进行肿瘤的预防和治疗提供理论依据。

参考文献：

[1] RINGEL M D, HAYRE N, SAITO J, et al. Overexpression and overactivation of Akt in thyroid carcinoma[J]. Cancer Research, 2001,61(16): 6105-6111.

[2] NISHIMURA Y, TAKIGUCHI S, ITO S, et al. EGF stimulated AKT activation is mediated by EGFR recycling via an early endocytic pathway in a gefitinibresistant human lung cancer cell line[J]. International Journal of Oncology, 2015, 46(4): 1721-1729.DOI:10.3892/ijo.2015.2871.

[3] BISWAS R, MONDAL A, AHN J C. Deregulation of EGFR/PI3K and activation of PTEN by photodynamic therapy combined with carboplatin in human anaplastic thyroid cancer cells and xenograft tumors in nude mice[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B Biology, 2015, 148: 118-127. DOI:10.1016/j.jphotobiol.2015.03.024.

[4] DUAN H, QU L, SHOU C. Activation of EGFR-PI3K-AKT signaling is required for Mycoplasma hyorhinis-promoted gastric cancer cell migration[J]. Cancer Cell International, 2014, 14(1): 135-143.DOI:10.1186/s12935-014-0135-3.

[5] PARK J H, DARVIN P, LIM E J, et al. Hwanggeumchal sorghum induces cell cycle arrest, and suppresses tumor growth and metastasis through Jak2/STAT pathways in breast cancer xenografts[J]. PLoS ONE, 2012, 7(7): e40531. DOI:10.1371/journal.pone.0040531.

[6] TOMAS-BARBERAN F A, SELMA M V, ESPIN J C. Interactions of gut microbiota with dietary polyphenols and consequences to human health[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care,2016, 19(6): 471-476. DOI:10.1097/MCO.0000000000000314.

[7] 张小利, 王慧清, 张月巧, 等. 植物多酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗肿瘤作用研究进展[J]. 食品科学, 2015, 36(5): 227-232.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505042.

[8] TALEB H, MADDOCKS S E, MORRIS R K, et al. The antibacterial activity of date syrup polyphenols against S. aureus and E. coli[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 198-206. DOI:10.3389/fmicb.2016.00198.

[9] SHIN S Y, YOON H, AHN S, et al. Structural properties of polyphenols causing cell cycle arrest at G1 phase in HCT116 human colorectal cancer cell lines[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(8):16970-16985. DOI:10.3390/ijms140816970.

[10] DARVIN P, JOUNG Y H, KANG D Y, et al. Tannic acid inhibits EGFR/STAT1/3 and enhances p38/STAT1 signalling axis in breast cancer cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2017, 21(4): 720-734. DOI:10.1111/jcmm.13015.

[11] RUAN H, ZHANG Z, TIAN L, et al. The Salmonella effector SopB prevents ROS-induced apoptosis of epithelial cells by retarding TRAF6 recruitment to mitochondria[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 478(2): 618-623. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.116.

[12] WEST A P, BRODSKY I E, RAHNER C, et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS[J]. Nature,2011, 472: 476-480. DOI:10.1038/nature09973.

[13] CAI N, DAI S D, LIU N N, et al. PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors in proliferation of retinal pigment epithelial cells[J]. International Journal of Ophthalmology, 2012, 5(6): 675-680.DOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2012.06.05.

[14] COSTA C, PEREIRA S, LIMA L, et al. Abnormal protein glycosylation and activated PI3K/Akt/mTOR pathway: role in bladder cancer prognosis and targeted therapeutics[J]. PLoS ONE, 2015, 10(11): e0141253.DOI:10.1371/journal.pone.0141253.

[15] DAVERI E, MAELLARO E, VALACCHI G, et al. Inhibitions of mTORC1 and 4EBP-1 are key events orchestrated by Rottlerin in SK-Mel-28 cell killing[J]. Cancer Letters, 2016, 380(1): 106-113.DOI:10.1016/j.canlet.2016.06.018.

[16] JASTRZEBAKI K, HANNAN K M, TCHOUBRIEVA E B,et al. Coordinate regulation of ribosome biogenesis and function by the ribosomal protein S6 kinase, a key mediator of mTOR function[J].Growth Factors, 2007, 25(4): 209-226. DOI:10.1080/08977190701779101.

[17] YANG W L, WANG J, CHAN C H, et al. The E3 ligase TRAF6 regulates Akt ubiquitination and activation[J]. Science, 2009, 325: 1134-1138.DOI:10.1126/science.

[18] PRIGENT S A, LEMOINE N R. The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands[J]. Progress in Growth Factor Research, 1992, 4(1): 1-24. DOI:10.1016/0955-2235(92)90002Y.

[19] NISHIKAWA R, JI X D, HARMON R C, et al. A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(16): 7727-7731.

[20] LIU Z, HAN L, DONG Y, et al. EGFRvIII/integrin beta3 interaction in hypoxic and vitronectinenriching microenvironment promote GBM progression and metastasis[J]. Oncotarget, 2016, 7(4): 4680-4694.DOI:10.18632/oncotarget.6730.

[21] JIAO S, ZHANG Z, LI C, et al. The kinase MST4 limits inflammatory responses through direct phosphorylation of the adaptor TRAF6[J].Nature Immunology, 2015, 16(3): 246-257. DOI:10.1038/ni.3097.

[22] WALSH MC, LEE J, CHOI Y. Tumor necrosis factor receptorassociated factor 6 (TRAF6) regulation of development, function, and homeostasis of the immune system[J]. Immunological Reviews, 2015,266(1): 72-92. DOI:10.1111/imr.12302.

[23] JI Y X, ZHANG P, ZHANG X J, et al. The ubiquitin E3 ligase TRAF6 exacerbates pathological cardiac hypertrophy via TAK1-dependent signalling[J]. Nature Communications, 2016, 7: 11267. DOI:10.1038/ncomms11267.

[24] ZHANG L, WANG Y, XIAO F, et al. CKIP-1 regulates macrophage proliferation by inhibiting TRAF6-mediated Akt activation[J]. Cell Research, 2014, 24(6): 742-761. DOI:10.1038/cr.2014.53.

[25] LEE H J, JANG S H, KIM H, et al. PINK1 stimulates interleukin-1betamediated inflammatory signaling via the positive regulation of TRAF6 and TAK1[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2012, 69(19): 3301-3315. DOI:10.1007/s00018-012-1004-7.

[26] RAJAGOPALAN S, LEE E C, DUPRIE M L, et al. TNFR-associated factor 6 and TGF-beta-activated kinase 1 control signals for a senescence response by an endosomal NK cell receptor[J]. Journal of Immunology,2014, 192(2): 714-721. DOI:10.4049/jimmunol.1302384.

[27] XIAO F, WANG H, FU X, et al. TRAF6 promotes myogenic differentiation via the TAK1/p38 mitogen-activated protein kinase and Akt pathways[J]. PLoS ONE, 2012, 7(4): e34081. DOI:10.1371/journal.pone.0034081.

[28] JEONG B, JEONG E S, MALAZARTE J M, et al. Physiological and molecular response of prorocentrum minimum to tannic acid: an experimental study to evaluate the feasibility of using tannic acid in controling the red tide in a eutrophic coastal water[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2016, 13(5): 503-516. DOI:10.3390/ijerph13050503.

[29] WHITE H A, JIN Y, CHICOINE L G, et al. Hypoxic proliferation requires EGFR-mediated ERK activation in human pulmonary microvascular endothelial cells[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology, 2017, 312(5): L649-L656.DOI:10.1152/ajplung.00267.2016.

[30] HE Z, HUANG C, LIN G, et al. siRNA-induced TRAF6 knockdown promotes the apoptosis and inhibits the invasion of human lung cancer SPC-A1 cells[J]. Oncology Reports, 2016, 35(4): 1933-1940.DOI:10.3892/or.2016.4602.