牛乳α-乳白蛋白免疫球蛋白G线性表位的关键氨基酸识别

丛艳君，李 晔，刘家琦，陈 澍，于晓凤，李林峰

乳及乳制品因其营养丰富而深受广大民众喜爱，但同时，乳类也是国际粮农组织公布的8大类食物过敏原之一[1]，牛乳过敏问题一直以来广受关注。α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）是牛奶中的主要过敏原之一，大约占牛奶总蛋白含量的5%，乳清蛋白的25%[2]。ALA属于溶菌酶家族，为单体球状蛋白质，其分子质量为14.2 kDa，含有123 个氨基酸，4 个二硫键[3]。牛乳ALA是由乳腺上皮细胞分泌的，其主要功能为通过半乳糖基转移酶系统调节乳糖的合成[4]。牛源和人源的ALA具有74%的同源性和6%的相似性。在食品工业中，ALA是婴儿配方食品的重要组成成分，这是因为它含有多种必需氨基酸，并具有多种生理功能，如抑制结肠癌作用和抗炎症作用等[5]。

过敏原表位是过敏原中参与结合抗体的组成部分，是蛋白质引发食物过敏反应的免疫学物质基础[6]。从免疫学机制来看，食物过敏可分为免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导和非IgE介导两大类。一些研究表明，在牛奶过敏疾病中，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）发挥着重要的作用，一些持续性牛乳过敏患儿和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量显著高于正常水平[7-8]，但是IgG介导的牛乳过敏反应机制目前报道较少。

本研究首先参考文献[4]收集对牛乳ALA过敏的婴幼儿血清，然后用血清识别ALA的IgG作用表位，进而通过丙氨酸免疫表位扫描技术识别降低ALA致敏性的关键氨基酸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

链霉亲和素、Costar 96 孔酶标板 北京拜尔迪生物技术有限公司；ALA、4-氯-1-萘酚、三氟乙酸、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的单克隆鼠抗人IgG 美国Sigma公司；ALA多肽为实验室合成。

1.2 仪器与设备

LRH-250F生化培养箱 上海捷呈实验仪器有限公司；550型酶标仪 美国Bio-Rad公司；C18液相色谱柱、1200型高效液相色谱仪、5975E型质谱仪 美国安捷伦科技公司；PSI 200多通道多肽合成仪 美国多肽科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳过敏患者血清的收集

根据典型的食物过敏史（临床症状均表现为特异性皮炎）、ImmunolCAP实验筛选8 例ALA牛乳过敏患者（6个月～3 岁，平均年龄为1 岁），收集血清，8 例牛乳过敏患者血清特异性IgG含量在80～100 kU/L，如表1。同时收集5 例非牛乳过敏症幼儿（1～3 岁）的血清用作阴性对照。阳性血清及阴性血清由北京友谊医院提供，用来鉴别IgG表位和关键氨基酸。

表1 ALA过敏患者血清IgG水平Table 1 Serum levels of total IgG from ALA allergic patients

1.3.2 ALA多肽的合成、纯化及鉴定

基于ALA的氨基酸序列，错位合成23 条长度为15 个氨基酸的ALA多肽。

合成方法为9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc）固相合成法[9]，即用含有游离的羟基的Fmoc-氨基酸-Wang树脂在多肽合成仪上完成多肽的合成。多肽的合成以第一个Fmoc-氨基酸通过酯化反应连接到Wang树脂开始。反应后，连接到Wang树脂上的氨基酸残基通过乙酰化反应保护起来，使它们不能进行后续的步骤。其他氨基酸重复这个过程依次连接。连接完最后一个氨基酸后，加入体积比为1∶1∶0.05的二氯甲烷/三氟乙酸/三异丁基硅烷的混合物，切割氨基酸侧链的保护基团和树脂，Fmoc保护基团通过添加哌啶被移出，然后用二氯甲烷和甲醇洗涤。过滤后，裂解剂在真空条件下被去除，用叔丁基甲基醚冷沉淀得到粗肽，真空干燥，再溶于水冻干。

合成多肽的纯化用C18反相高效液相色谱柱完成，梯度洗脱液为0.1%（体积分数，下同）三氟乙酸-水和0.1%乙腈-水，流速为12.0 mL/min。合成多肽的准确性通过质谱测定分子质量进行鉴定，采用电喷雾离子源，喷雾压力为0.1 MPa，干燥气温度350 ℃，流速为5 L/min，扫描范围为m/z 500～2 200。

1.3.3 IgG作用表位和关键氨基酸的识别

通过间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）识别IgG作用表位和关键氨基酸[10]。将连接链霉亲和素的多肽加入到酶标板中进行包被后洗涤，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（含质量分数1%牛血清白蛋白）封闭，洗涤之后加入个体血清或者混合血清分别识别IgG作用表位或者关键氨基酸。二抗为HRP标记的单克隆鼠抗人IgG，显色液为4-氯-1-萘酚，检测波长为450 nm，630 nm作为参照波长，以消除非特异性吸附。在参照波长下检测物光的吸收最小。最后的结果是检测波长和参照波长的OD值之差。阴性血清作为对照。

作用表位是被65%以上过敏患者个体血清识别的多肽[2]。关键氨基酸是作用表位的氨基酸被丙氨酸取代后合成的多肽的致敏性消失的氨基酸。

1.4 数据分析

所有实验均做3 次平行，3 次重复。统计分析采用Excel 2010进行，使用ANOVA分析数据的差异水平，以Kruskal-Wallis检验P＜0.05作为差异显著。ALA的三维结构图用Pymol软件制作。

2 结果与分析

2.1 多肽合成

基于蛋白质数据库（the protein databank，PDB）中ALA氨基酸序列，本研究合成了23 条重叠肽（P1～P23），涵盖了ALA 123 个氨基酸，肽的长度是15 个氨基酸，每相邻2 条肽错位5 个氨基酸，重复10 个氨基酸，见表2，合成的多肽属于ALA大部分氨基酸序列。多肽合成后用反相高效液相色谱纯化，纯度均在85%以上，并用质谱通过测定多肽的分子质量验证了合成多肽的准确性。

表2 基于ALA氨基酸序列合成的23 条多肽Table 2 Twenty-three peptides synthesized based on the amino acid sequence of ALA

2.2 IgG作用表位的识别

本研究以多肽与血清反应的OD值来表示结合的强度，反应孔颜色越深，OD值越大，以OD值大于0.50为反应程度强，大于0.25为反应程度较强，大于0.10为反应程度较弱，低于0.10为无反应。实验组的OD值大于阴性对照组的2 倍时判定为阳性结果，多肽与非牛乳过敏患者血清均表现为无反应（阴性对照的OD值为0.05）。如表3所示，多数多肽与患者血清IgG都发生了特异性阳性反应， 但是反应程度不同，并且识别率不同。其中编号为P2的多肽（aa6～20）和编号为P5的多肽（aa21～35）的识别率为100%（8/8，即与8 份血清均发生特异性反应）。aa36～50（P8）和aa86～100（P18）的识别率为75%（6/8）。P4、P9、P11和P13的识别率为37.5%（3/8）。多肽P1、P3、P6、P7、P10、P12、P14、P15、P17、P19、P20，P22的识别率为25%（2/8），P23与1 份血清发生了反应。多肽P16和P21与血清未发生特异性反应。通过比对PDB数据库，用Pymol软件制作ALA的三维结构图，见图1，ALA的IgG作用表位在氨基酸序列中的定位为aa6～20、aa21～35、aa36～50和aa86～100，以绿色区域表示IgG作用表位。

图1 ALA的3D结构图Fig. 1 3D structure of ALA

表3 牛乳过敏患者血清识别ALA IgG作用表位Table 3 IgG-binding epitopes of ALA identified with individual serum from cow milk allergic patients

2.3 丙氨酸免疫表位扫描技术识别ALA IgG作用表位

以识别率100%的作用表位aa6～20和aa21～35为研究对象，识别关键氨基酸。即用丙氨酸依次取代作用表位上的氨基酸，合成多肽，以aa6～20和aa21～35为对照，用阳性混合血清通过ELISA方法识别新合成的多肽，比较OD值大小。

图2 识别作用表位aa6～20的关键氨基酸的OD值Fig. 2 Identification of the critical amino acids in the epitope aa 6–20

如图2所示，第9位的苯丙氨酸（Phe）、第15位的亮氨酸（Leu）分别被丙氨酸取代后合成的多肽OD值为零，多肽致敏性消失。与对照组相比，第11位的谷氨酸（Glu）被丙氨酸取代后合成的多肽OD值显著增加（P＜0.05），第17位的甘氨酸（Gly）被丙氨酸取代后合成多肽的OD值显著降低（P＜0.05），其他氨基酸被丙氨酸取代后的多肽OD值与对照组（aa6～20）差异不显著（P＞0.05）。

图3 识别作用表位aa21～35的关键氨基酸的OD值Fig. 3 Identification of the critical amino acids in the epitope aa 21–35

同理，如图3所示，第24位的脯氨酸（Pro）、第26位的色氨酸（Trp）和第32位的组氨酸（His）分别被丙氨酸取代后合成的多肽OD值为零，多肽致敏性消失。与对照组（aa21～35）相比，第22位丝氨酸（Ser）、第25位谷氨酸（Glu）、第27位缬氨酸（Val）和第29位的苏氨酸（Thr）被取代后合成的多肽OD值显著降低（P＜0.05），其他氨基酸被取代后合成多肽的OD值与对照组差异不显著（P＞0.05）。

基于以上数据，第9位的苯丙氨酸，第15位的亮氨酸，第24位的脯氨酸，第26位的色氨酸和第32位的组氨酸是影响ALA致敏性的关键氨基酸。这些重要的氨基酸残基的空间位置见图1。

3 讨 论

牛乳是婴幼儿最早接触的食物，也是5 岁以内幼儿的主要过敏原，在发达国家大约2%～3%的幼儿对牛乳过敏[11]。其中，牛乳中ALA IgE识别率为6%～100%[7,12-13]。虽然IgG被认为是正常人食用牛乳蛋白或者对牛乳蛋白免疫耐受后血清中都会产生的抗体[7]，但是一些研究表明，对β-乳球蛋白过敏患者血清中IgG含量显著高于免疫耐受患者[14-17]。本研究收集IgG介导的牛乳过敏患者血清，用血清识别ALA的作用表位和关键氨基酸，探索牛乳ALA过敏机理。

牛乳过敏原ALA表位的识别方法主要有以下3 种：第一种是利用化学或酶法将过敏原“切割”成片段，然后逐个识别多肽的致敏性或抗原性。Hopp等[18]采用酶水解法研究牛乳ALA免疫学性质，发现ALA的酶解肽段中aa4～18、aa60～80、aa91～94、aa105～117、aa119～123对天然ALA与兔血清的结合有不同程度的抑制作用。Järvinen等[10]采用酶法裂解合成的重叠多肽定位出3 个牛乳ALA IgG结合表位。第二种是肽文库技术，即建立噬菌体肽库，用特异性血清中IgE或IgG筛选某种过敏原的线性表位，并进行序列定位。Li Xin等[19]利用噬菌体随机肽库技术筛选得到牛乳ALA线性和构象表位，并通过生物信息学工具确定IgG和IgE表位。第三种是化学合成技术，即利用固相合成肽技术合成过敏原的重叠肽（每隔若干个氨基酸重叠），肽的长度一般是10～15 个氨基酸，然后用相应的抗体与这些多肽反应来确定表位[20-22]。Hochwallner等[23]化学合成了ALA的8 条多肽，用牛乳过敏患者血清识别发现多肽aa1～19的识别率为23.7%，aa15～34的识别率为47.4%。本研究采用‘丙氨酸免疫表位扫描技术’合成ALA系列多肽，以牛乳过敏患者血清为探针，通过ELISA方法识别ALA的作用表位和关键氨基酸。

牛乳过敏是由IgE介导或者非IgE介导的I型过敏反应，患者接触牛奶后会导致全身性荨麻疹、支气管收缩、血管性水肿和全身型过敏等症状。通过细胞因子和免疫调节细胞介导的进一步延迟或后期免疫反应也属于牛乳过敏的临床范围，如特异性皮炎[24]。在本研究中，8 例患者血清中IgG含量显著高于其他抗体，均出现特异性皮炎的临床症状，期望本研究结论可以为作用表位的识别模式与致敏个体的临床症状的关系研究提供理论依据。

本实验识别到ALA 4 个IgG结合序列，分别为aa6～20、aa21～35、aa36～50和aa86～100，作用表位aa6～20、aa86～100与Hopp等[18]使用兔抗血清识别的aa4～18、aa91～94表位部分一致，这些区域具有亲水性。另外，Järvinen等[10]采用合成的重叠多肽定位出3 个牛乳ALA IgG结合表位，分别为aa7～18、aa51～61、aa89～108，本研究识别的作用表位aa6～20、aa86～100部分验证了Järvinen的结论。同时Järvinen等[10]发现了ALA的IgE和IgG都能识别到的作用表位，本研究同样定位了牛乳过敏患者IgG和IgE作用表位的重叠区域（见图1中黄色区域），即作用表位aa6～20和aa46～50，可以同时被牛乳过敏患者血清中的IgE和IgG识别。这表明，牛乳ALA中引起过敏的区域与抗原区域并不完全对应，Maynard等[25]也有类似报道。作用表位aa6～20和aa21～35识别率为100%，且前者是国外文献曾经报道过的，后者是本研究新识别到的，这2 个作用表位均暴露于ALA过敏原表面，易于与抗体结合[26-28]，因此本研究重点探究这2 个作用表位的关键氨基酸。

不同文献所识别的抗原表位不同的原因可能有：1）表位定位的方法不同，本实验采用重叠肽方法进行定位，而Järvinen等[10]采用酶水解法，这2 种方法的不同在于多肽的片段大小及所处的微环境不同，这种差异可能会影响多肽与抗体的结合；2）物种的差异，牛乳过敏患者遗传背景不同，来源不同的血清，筛选到的表位会有所不同。

考虑到丙氨酸是中性氨基酸，相对分子质量较小，不会显著改变肽的溶解度或电荷，所以本研究以丙氨酸作为替换氨基酸来寻找IgG结合表位的关键氨基酸。这种方法已成功用于其他过敏原关键氨基酸的分析[29-31]。本研究发现，作用表位aa6～20第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸被丙氨酸取代后合成的多肽与IgG的结合能力丧失。作用表位aa21～35上有3 个氨基酸在被丙氨酸取代之后合成的多肽与IgG结合能力显著降低（P＜0.05），分别为第24位的脯氨酸、第26位的色氨酸和第32位的组氨酸。本研究结论可以为食物过敏免疫治疗剂的发展提供理论依据，或根据需要修饰设计氨基酸、重组蛋白，生产不会结合血清和肥大细胞IgE或者IgG的蛋白，这也是未来研究的重点内容。那些没有被IgG识别的其他氨基酸，可以为“过敏原沉默”的研究提供思路。另外，我国牛乳过敏症的低发病率，增加了收集牛乳过敏患者血清的难度。但是，本研究结论为未来形成一般性结论提供了基本数据和理论方法。我们将在未来几年继续收集牛乳过敏患者血清，继续致力于牛乳过敏机制的研究。

本实验室前期研究发现，ALA的IgE关键氨基酸为第8位的缬氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位组氨酸[32]。因此，第9位的苯丙氨酸是ALA的IgE和IgG作用表位的共同关键氨基酸，这个结果表明，可以通过修饰此氨基酸，从而降低ALA的致敏性和抗原性。此外，IgE和IgG结合表位的相同氨基酸残基可以为IgG和IgE抗体生成关系的研究提供重要信息。

4 结 论

通过丙氨酸免疫表位扫描技术和ELISA方法识别到降低ALA IgG作用表位的关键氨基酸，为第9位的苯丙氨酸、第15位的亮氨酸、第24位的脯氨酸、第26位的色氨酸和第32位的组氨酸。进一步研究发现，第9位的苯丙氨酸是ALA的IgE和IgG作用表位的共同关键氨基酸，这为通过基因工程技术重组过敏原蛋白以降低致敏性提供了重要的信息。

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