凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表达分析

宋巧珍，邹枘峰，张亦陈，耿绪云，刘逸尘 *

(1.天津市动植物抗性重点实验室/天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津市水生动物疫病预防控制中心，天津 300221)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾(Pacific White Shrimp)，隶属于节肢动物门、甲壳纲，其具有生长快、繁殖期长、含肉率高和便于活虾运输等特点，是世界范围内对虾养殖的三大品种之一[1]。但近年来，在病原活跃、养殖环境恶化和宿主抵抗力下降三方面因素共同作用下，对虾病害频发，给我国养殖产业造成了巨大的经济损失，因此深入开展对虾免疫防御机制研究，增强其抗病能力，显得尤为重要。

凡纳滨对虾属于无脊椎动物，缺乏获得性免疫系统，只能依靠天然免疫系统(细胞免疫和体液免疫)来抵御和杀死入侵的病原[2-3]。其体液免疫主要利用凝血级联反应、酚氧化酶激活系统等一系列效应因子参与免疫应答反应[4]。此外，虾蟹类体内的一些其他组分如丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂等分子会作为级联反应中的调控因子参与免疫反应。丝氨酸蛋白酶家族作为一种蛋白水解酶，其以丝氨酸为活性中心，在生物有机体中起着重要的作用[5-6]。clip-SP家族在氨基端含有1个clip结构域，此结构域最初在马蹄蟹的凝固酶原中被发现，研究结果发现它在免疫反应中具有重要调节功能[7]，其中6个半胱氨酸可形成3个链内二硫键[8-9]；羧基端含有丝氨酸蛋白酶样结构域(SP结构域)，其中丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸这3个氨基酸会形成催化三联体发挥作用。无脊椎动物中，丝氨酸蛋白酶家族在胚胎发育和防御反应的信号级联反应中发挥重要作用，例如马蹄蟹的凝血反应[10]、果蝇抗菌肽的合成[11]、昆虫和甲壳纲动物中酚氧化酶原系统的激活等[12-13]。同时，补体系统(包括经典途径、凝集素途径和旁路途径)必须先通过一系列丝氨酸蛋白酶(serine proteases,SP)的酶促级联反应激活后才能发挥生物学效应。经典途径中，对抗原抗体复合物(IC)的识别由C1q介导，其中的SP主要是C1r和C1s；凝集素途径中，识别分子是甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)[14-15]，MBL识别并结合外源病原物质，进一步与MBL相关的SP(MBL Associated Serine Proteinase,MASP)结合形成复合物并激活补体因子C3，形成膜攻击复合物(MAC)，导致异源微生物裂解死亡，进而发挥免疫作用[16-17]。该研究拟获得凡纳滨对虾Lv-SP基因，探讨序列特点及组织分布特征，并分析其应答病毒侵染的表达变化模式，以期为深入探讨其作为免疫调控基因在对虾防御应答过程中的作用机制奠定基础，并应用于对虾的健康养殖和病害防治。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究材料。健康的凡纳滨对虾(购于天津市西青区对虾养殖基地)，体长11～14 cm，体重9～14 g，于实验室循环养殖系统中(16 ℃，盐度10‰，氧气充足)暂养4～5 d再进行试验。

1.1.2载体和菌株。pMD18-T-Vector (TaKaRa )，大肠杆菌DH5α菌种由天津师范大学水生生物学研究室保存。

1.1.3主要试剂。SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工)、ExTaq酶(TaKaRa)、2×TaqPCR Master Mix (Promega)、LB液/固体培养基(生工)、M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)、GoTaq®MasterMix (Promega)、T4DNA连接酶(TaKaRa)等。

1.1.4主要仪器。PCR仪(BIO-RAD)、电泳仪(DYY-6C)、超净工作台(SW-CJ-1FD)、7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems)、移液器(Eppendorf)等。

1.2方法

1.2.1凡纳滨对虾总RNA提取及cDNA合成。利用Trizol方法提取凡纳滨对虾血细胞、肝、鳃等组织的RNA，用于后期基因克隆操作，经1% MOPs琼脂糖凝胶电泳进行定性检测，再通过NANO Drop 2000分光光度计进行定量检测，确认RNA浓度和完整性后利用M-MLV Reverse Transcriptase 反转录体系并且加入接头引物BDA、AOLP(表1)进行cDNA的合成。

1.2.2引物设计与Lv-SPORF区域的扩增。从实验室前期凡纳滨对虾转录组测序结果中筛选出SP基因进行引物设计(生工)，引物包括Lv-SPF1、Lv-SPR1和Lv-SPF2、Lv-SPR2(表1)共2对。利用PCR技术扩增目的基因，电泳检测后将PCR产物利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化后连接到pMD18-T-Vector上，转入到大肠杆菌DH5α中，送英潍捷基公司进行测序，利用Bioedit软件和在线BLAST程序分析测序结果与目的基因是否一致，进而确定是否获得Lv-SP基因ORF区。

1.2.3生物信息学分析。首先利用Expasy的在线分析工具(http://web.expasy.org)对Lv-SP基因ORF区进行翻译获得蛋白质序列、预测其分子量及等电点、利用其SMART程序分析Lv-SP蛋白的功能结构域，并利用其SignalP 4.1 Server分析其是否含有信号肽，通过TMHMM 2.0对Lv-SP蛋白序列进行跨膜分析。使用Bioedit、ClustalX 1.83以及MEGA 6.0软件对Lv-SP氨基酸和其他物种如中国明对虾、中华绒螯蟹、果蝇等的SP、SPH氨基酸序列进行多重比对，并使用Neighbour-Joining法构建系统进化树(Bootstrap=10000)。

1.2.4Lv-SP基因组织表达分析。根据克隆的Lv-SP基因序列，设计荧光定量PCR试验组引物Lv-SPqf，Lv-SPqr和对照组引物β-actinf，β-actinr(表1)，将凡纳滨对虾各组织提取的RNA反转成浓度相近的cDNA，参考GoTaq®MasterMix说明，利用荧光定量PCR方法检测Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中表达量的差异。定量PCR反应体系设计为GoTaq®MasterMix 12.5 μL，Nuclease-Free Water 8.50 μL，引物1 μL，cDNA 2 μL，总体积25 μL。定量PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，40个循环；最后进行融解曲线分析。所获得的数据利用2-△△Ct法和t检验方法进行统计分析并计算Lv-SP基因相对表达量的显著性差异。

1.2.5人工感染白斑杆状病毒(WSSV)对凡纳滨对虾Lv-SP基因表达的影响。人工感染克氏原螯虾富集足量的WSSV病毒，并稀释到105拷贝数/μL。从试验组和对照组各选取50只经检测的健康凡纳滨对虾，分别注射10 μL WSSV 和Tris-NaCl缓冲液(TN-buffer，用于稀释WSSV)，分别在注射后0、0.5、5.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h抽取对虾血淋巴，提取血细胞RNA并反转录制备cDNA，设计对照组引物TPI-qf，TPI-qr(表1)，利用qPCR分析凡纳滨对虾Lv-SP基因的表达变化特征(方法同“1.2.4”)。

表1 试验所用引物

2 结果与分析

2.1Lv-SP基因cDNA序列特征及生物信息学分析Lv-SP基因包含1个1 104 bp的ORF区，编码367个氨基酸(图1)，预测其蛋白分子量为41 kD，等电点为6.93。SignalP 4.1 Server预测结果显示：Lv-SP氨基酸序列氨基端含有23个氨基酸的信号肽，同时TMHMM 2.0预测显示Lv-SP蛋白位于细胞外发挥作用。SMART预测结果显示Lv-SP蛋白含有1个clip结构域和1个高度保守的TryP-SPc结构域。在clip结构域中，包含6个半胱氨酸，可以形成3个二硫键；在TryP-SPc结构域中，包含SP家族中3个典型的氨基酸组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)，形成催化三联体发挥功能。

注：蓝色方框表示信号肽，黑色下划线表示clip结构域，红色下划线表示TryP-SPc结构域，黑色方框表示6个半胱氨酸(C)，红色方框表示组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和丝氨酸(S)Note：The sequence in blue box represents the signal peptide,the clip domain is underlined by black line,the TryP-SPc domain is underlined by red line,the bases (C) in black box represents six cysteines and the bases in red box represents histidine (H),aspartic acid(D) and serine (S)图1 Lv-SP基因的cDNA序列及相应蛋白的氨基酸序列Fig.1 The ORF cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of Lv-SP

2.2Lv-SP的多重序列比对及进化发生分析将Lv-SP氨基酸序列与其他物种SP氨基酸序列进行多重比对(图2)发现，这12种SP及SPH序列在蛋白水平上具有较高序列相似性。进一步构建系统发生树显示：Lv-SP蛋白与南美白对虾、中华绒螯蟹相似性比较高，亲缘关系比较近，进化上为一个亚群；而与按蚊、小蜂窝甲虫亲缘关系比较远(图3)。

2.3Lv-SP基因的组织表达分析利用RT-PCR分析Lv-SP基因在不同组织中的表达水平，结果显示：该基因在凡纳滨对虾的血细胞、肝、鳃、胃等9个组织中均有表达，其中在鳃和血细胞中的表达量较高，在心和肝中表达量较低(图4)。

2.4WSSV侵染对凡纳滨对虾Lv-SP基因表达的影响WSSV的体内人工感染试验结果显示，注射WSSV后24 h之内Lv-SP基因在试验组和对照组的表达均没有明显变化，但在感染后48.0 h和72.0 h，Lv-SP基因的表达量均有极显著上调趋势(P<0.01)(图5)。由此推测Lv-SP基因可能在病毒感染晚期参与了应答WSSV的免疫防御反应。

3 结论与讨论

在无脊椎动物中，含clip结构域的丝氨酸蛋白酶家族成员在胚胎发育和防御反应的信号级联反应中都发挥着重要作用，目前对于丝氨酸蛋白酶在节肢动物中的作用机理报道还比较少。已有研究表明丝氨酸蛋白酶中clip结构域都含有6个保守的半胱氨酸，可以形成3个二硫键，在该研究中，克隆得到的Lv-SP基因编码的氨基酸具有一个典型的信号肽结构，表明它在胞外执行功能，其氨基端的clip结构域含有6个保守的半胱氨酸，可以形成3个二硫键，预测形成的3个二硫键在稳定蛋白结构中可能发挥一定的作用，clip结构域可能提供了一个用于蛋白酶和其上游激活剂、下游蛋白底物或调节酶活力的辅因子相互作用的位点，使得在局部损伤和感染源的部位可以形成酶复合物。利用在线分析软件SMART预测：Lv-SP的C端含有的Tryp-SPc结构域中，其催化三联体是由His、Asp和Ser这3个氨基酸形成的，该结构域主要执行着消化和催化的功能。该研究获得的Lv-SP可能属于丝氨酸蛋白酶基因家族中的新成员。将Lv-SP蛋白序列在NCBI中进行Blast P比对，结果发现：该蛋白与其他物种的SP蛋白大致有40%～80%的相似度，在虾类中相似度都为60%以上，并且均具有较保守的clip结构域和SP结构域(Tryp-SPc)。之前有研究显示，普通的SP家族成员通常仅具有消化的功能，而含有clip结构域的SP主要参与免疫应答过程。Lv-SP与其他对虾SP和已报道的凡纳滨对虾Lv-SP2在氨基酸序列上的差异，表明它们在特征和功能上可能同样存在着显著区别，该研究中的Lv-SP基因可能在免疫调控过程中发挥着不可替代的重要作用。

注：Lv SP2(凡纳滨对虾AFW98996.1)；Fc SP(中国明对虾，AFW98989.1)；Es c-SP(中华绒螯蟹，AKN46053.1)；Pm c-SP(斑节对虾，ACP19561.1)；Ha SP(端足虫，XP_018023883.1)；Sp SP(拟穴青蟹，AUC65357.1)；Ag SP(按蚊，AAD38334.1)；Ad c-SP(大劣按蚊，ABE97918.1)；Pt c-SP(三疣梭子蟹，AFA42362.1)；Dm SP(果蝇，XP_017144359.1)；At SPH(小蜂窝甲虫，XP_019880096.1)Note:Lv SP2 (Litopenaeus vannamei,AFW98996.1);Fc SP (Fenneropenaeus chinensis,AFW98989.1);Es c-SP (Eriocheir sinensis,AKN46053.1);Pm c-SP (Penaeus monodon,ACP19561.1);Ha SP (Hyalella azteca,XP_018023883.1);Sp SP (Scylla paramamosain,AUC65357.1);Ag SP (Anopheles gambiae,AAD38334.1);Ad c-SP (Anopheles dirus,ABE97918.1);Pt c-SP (Portunus trituberculatus,AFA42362.1);Dm SP (Drosophila miranda,XP_017144359.1);At SPH (Aethina tumida,XP_019880096.1)图2 凡纳滨对虾Lv-SP与其他物种氨基酸序列多重比对Fig.2 Multi-alignment of Lv-SP with other SPs from different species

Lv-SP基因的组织表达特征分析能为预测其基因功能提供有价值的参考。Lv-SP基因在凡纳滨对虾中具有一定的组织表达特异性，在血细胞和鳃组织中表达量较高，而在心中表达量最低，血细胞和鳃都是重要的免疫器官或组织，鳃在对虾中作为病原微生物的过滤器，是一个非常重要的免疫防御器官，这种器官上明显的表达差异也许暗示着某种功能上的差异，Lv-SP基因在其中的高表达可能与宿主自身的免疫防御作用有关[18-20]，组织表达特征也间接表明了其在对虾免疫调控过程中的作用。

图3 凡纳滨对虾Lv-SP与其他物种SP的进化发生分析Fig.3 Phelogenetic analysis of the Lv-SP with other SPs from different species

图4 凡纳滨对虾Lv-SP基因组织表达分析Fig.4 Expression analysis of Lv-SP gene in different tissues

图5 WSSV感染后凡纳滨对虾血细胞Lv-SP基因的相对表达量Fig.5 Relative expression of Lv-SP gene after WSSV challenge in hemocytes

甲壳动物缺乏获得性免疫系统，只能依靠自身天然免疫系统来抵抗外界各种病原体的入侵。对虾WSSV是一种死亡率极高的病毒，实验室条件下人工感染48.0 h内就会出现较高的死亡率。探讨对虾关键免疫基因应答WSSV侵染的表达变化特征，将有助于研究该基因在抗病毒免疫应答过程中的作用。天津师范大学水生生物学研究室前期转录组分析结果显示Lv-SP基因具有较灵敏的应答病毒侵染的特征，该研究利用qPCR技术，以WSSV感染后具有较稳定表达水平的磷酸丙糖异构酶基因(TPI)作为内参基因，进一步在凡纳滨对虾活体感染WSSV后不同时期精确分析了其血细胞中Lv-SP基因的表达变化特征。研究结果表明病毒感染的早期和中期，该基因对病原的刺激没有显著应答变化，但在病毒感染晚期(48.0 h和72.0 h)，Lv-SP呈现极显著上调表达(P<0.01)，该基因在对虾血细胞中呈组成型表达，WSSV可以在一定范围内诱导其转录水平的增强，Lv-SP可能通过上调自身表达，调控其所在的酚氧化酶激活途径，进而参与到作用于病原的防御应答过程。

该研究克隆了凡纳滨对虾血细胞中的Lv-SP基因，探讨了其序列及保守性特点，分析了其组织分布特征以及应答病毒侵染的表达变化模式。作为一种分布较为广泛的蛋白，它在免疫过程中的诸多应答和级联反应中可能具有重要功能，未来可进一步探讨其精细的调节作用及在进化上的意义。

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