芽孢杆菌SDNY-037对黄瓜灰霉病的防治效果及其发酵条件的优化

王海利，张晓慷，张新刚

(山东省农药科学研究院，山东济南 250100)

近年来，随着国家对生态环境的高度重视，化学农药准入门槛越来越高，研制一种低毒低害、防效较好的化学农药也越来越难，因此，生防菌便成为近年来生物农药研发中的重点。芽孢杆菌是一类广泛存在于自然界的腐生细菌，因其对营养要求简单、繁殖速度快[1]、种类和数量众多，加之具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用，所以是广大生物农药研发者的研发对象，目前已有越来越多的芽孢杆菌菌剂被开发应用于市场。在农业上，芽孢杆菌常被用于制造生物肥料和生物农药，如巨大芽孢杆菌可以被制成混合菌剂，喷洒于土壤表面，以达到降解土壤中极其难溶的含磷化合物的目的。根瘤菌和自生固氮菌一直被用作固氮菌株应用于我国的微生物肥料中[2]。

黄瓜灰霉病是一种由真菌半知菌亚门灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers)侵染所引起的病害，在黄瓜栽培保护地可常年发病，近年来发病逐年趋重。据文献报道，灰霉病菌的拮抗微生物主要包括拮抗性真菌和拮抗性细菌，而芽孢杆菌则是灰霉病生物防治中研究和应用的主要细菌[3]。目前，我国应用拮抗细菌防治灰霉病的研究较少，而且大多由于直接应用菌株和菌剂进行病害防治，货架期很难保证[4]，因此，如何研发出高效、稳定的生防菌菌剂成为目前农药研究中的重点。为提高生防菌单位活菌量，笔者研究了一株芽孢杆菌SDNY-037对黄瓜灰霉病的防治效果，并优化了其发酵条件，为研制安全稳定的生防制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。灰霉病菌Bc(Botrytiscinerea)由上海南方农药创制中心生测试验室提供，芽孢杆菌SDNY-037由山东省农药科学研究院工艺研究所生化试验室保存。

1.1.2培养基。菌种活化培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，自来水1 000 mL，pH 7.2～7.4。菌种发酵基础培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1种子菌液的制备。将保存的菌种转接到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28 ℃培养48 h进行活化，活化后挑取部分菌落接于装液量为100 mL的250 mL锥形瓶的牛肉汤培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h即得种子菌液。

1.2.2含菌量与吸光度相关性的测定。将生防菌活化后，转接到牛肉汤培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下发酵24 h，菌液分别稀释5、10、20、40、80倍，每个稀释倍数再进行适当稀释，采用平板菌落计数法计算活菌量[5]，每个样品3个重复，取平均值。菌液吸光度的测定：以牛肉汤培养基为空白对照，测定对应菌液吸光度(OD600)，以OD值为横坐标，菌落数为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.3菌液对活体Bc和离体Bc的初步防治方法。①活体。取1 mL发酵48 h的发酵液，均匀喷洒到黄瓜幼苗(子叶期)叶片上，置通风处晾干，将Bc菌饼(培养4 d左右)倒置贴于黄瓜叶片上，以不喷菌液的黄瓜幼苗作为对照，置于保湿箱中发病。②离体。挑取活化好的生防菌菌落均匀点在菌种活化培养基上，中间接Bc菌饼，置于18 ℃培养箱中培养4 d。

1.2.4发酵培养基条件的优化。

1.2.4.1碳源筛选。分别选取葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖等量替换牛肉汤培养基中的碳源，以牛肉膏作为对照。以1%的接种量将种子液接种至液体培养基中(250 mL锥形瓶装液量为100 mL)，在28 ℃、150 r/min条件下振荡培养72 h，采用平板菌落计数法，分别计算菌落总数。

1.2.4.2氮源筛选。分别用大豆粉、尿素、氯化铵、硫酸铵、酵母膏等量替换牛肉汤培养基中的氮源，以蛋白胨作为对照，其他条件同“1.2.4.1”，计算不同氮源中的菌落总数。

1.2.5发酵条件的优化。对生防菌株发酵时间、初始pH、接种量、装液量等发酵条件进行优化。发酵时间设2、3、4 d；初始pH设3、5、7、9、11；接种量设1%、3%、5%、7%、9%、11%；装液量为250 mL的锥形瓶分别装液30、50、70、100、120 mL；其余条件同“1.2.4”，计算不同条件下的菌落总数。

2 结果与分析

2.1菌密度与吸光度的相关性由图1可知，标准曲线方程为y=95.97x-3.429 8,R2=0.991 1，相关性较好，故可用液体培养基的OD600来计算活菌量。

图1 菌密度与吸光度的相关性Fig.1 The correlation between the density of bacteria and the absorbance

2.2发酵培养基条件的优化以蛋白胨为固定氮源，选择不同碳源培养菌株。由图2可知，以麦芽糖为碳源时，活菌量达到最大，约为2.82×109cfu/mL,较以牛肉膏为碳源时的菌株活菌量提高了40%左右。

图2 不同碳源培养基及其菌落数Fig.2 Different carbon source culture medium and its bacterial colonies

以牛肉膏作为固定碳源，选择不同氮源培养菌株。由图3可知，以蛋白胨为氮源时，活菌量达到最大，约为9.2×108cfu/mL，其他氮源对于提高菌株活菌量影响不大。

图3 不同氮源培养基及其菌落数Fig.3 Different nitrogen source culture medium and its bacterial colonies

2.3发酵条件的优化

2.3.1菌株发酵时间。由图4可知，当发酵时间为72 h时，菌株活菌量达到最大，约为3.36×109cfu/mL，较发酵时间为48 h时的菌株活菌量提高了9%左右。

图4 不同发酵时间及其菌落数Fig.4 Different fermentation time and its bacterial colonies

2.3.2菌株发酵培养基pH。由图5可知，当pH为5时，菌株活菌量达到最大，约为1.8×109cfu/mL，较pH为7时的菌株活菌量提高了32%左右。

图5 不同pH及其菌落数Fig.5 Different pH and its bacterial colonies

2.3.3菌株接种量。由图6可知，当接种量占总体积的3%时，菌株活菌量达到最大，约为2.82×109cfu/mL，较接种量为1%时的菌株活菌量提高了4%左右。

图6 不同接种量及其菌落数Fig.6 Different inoculation amount and its bacterial colonies

2.3.4菌株发酵培养基装液量。结果表明，当250 mL锥形瓶装液量为120 mL时，菌株活菌量达到最大，约为1.6×109cfu/mL，较装液量为100 mL时的菌株活菌量提高了3%左右。

2.4菌株发酵液对黄瓜灰霉的防治效果

2.4.1离体防效。由图7可知，培养4 d左右的菌株对黄瓜灰霉的离体防效比较明显，点菌样的周围，黄瓜灰霉菌的生长受到抑制，只能向未点样的部分扩散生长。

注：编号1、2是1株芽孢杆菌SDNY-037分别转接到2个斜面Note:The number 1 and 2 indicated that one Bacillus SDNY-037 was transferred to two slopes,respectively图7 生防菌SDNY-037对黄瓜灰霉的离体防效Fig.7 Bio-control effect of SDNY-037 to Botrytis cinerea in vitro

2.4.2活体防效。接种致病菌48 h时，菌株发酵液防效约为75%，72 h时则基本无防效，说明菌株发酵液具有一定的防效，但是要提高防效，还需提高菌体密度。

3 结论与讨论

目前，关于生防细菌的报道较多，利用生防菌进行生物防治也有了较大的进展，并成为多样化的发展趋势[6]，但提高菌株活菌量仍是提高生防菌剂防效的重要基础。该研究就生防菌的发酵培养基以及发酵条件进行了探索。结果表明，适合该菌株生长的碳源、氮源分别是蔗糖和蛋白胨；在发酵时间为3 d、pH为5、接种量占总体积的3%、250 mL锥形瓶装液量为120 mL条件下，菌株活菌量均达到最大，为进一步提高菌株活菌量打下了基础。

不同细菌最适发酵培养基及发酵条件均不相同，可能是由于不同生理小种的特征不同所致[7]。该研究通过试验初步筛选了部分最适发酵条件，但对于大幅度提高该菌株的活菌量和生防效果，还需进一步研究，据文献报道，微量元素对提高菌量以及芽孢的形成具有明显的影响[8]，这对于产品的保存是非常有利的。

[1] 张艳春.生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究[D].天津:天津科技大学,2011:11.

[2] 樊继强.生防芽孢杆菌的筛选及其抗菌物质的分离纯化与鉴定[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2016 :15.

[3] 孟祥东，傅俊范，严雪瑞，等.灰霉病菌(Botrytiscinerea)生物防治研究进展[J].沈阳农业大学学报，2003，34(6): 472-475.

[4] 童蕴慧，纪兆林，徐敬友，等.灰霉病生物防治研究进展[J].中国生物防治，2003，19(3)：131-135.

[5] 陈琳，孟祥晨.响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件[J].食品科学，2011，32(3):176-180.

[6] 韩长志.植物病害生防菌的研究现状及发展趋势[J].中国森林病虫,2015,34(1):33.

[7] 纪明山，王毅婧.地衣芽孢杆菌生防菌株 SDYT-79 发酵条件优化[J].沈阳农业大学学报，2011，42(2):164-169.

[8] 胡尚勒,刘天贵.地衣芽胞杆菌营养要求的研究[J].河北省科学院学报,2000,17(4)：224-227.