复合益生菌发酵桑葚汁饮料的工艺优化

贾素中，杭晓敏

(上海交大昂立股份有限公司生物医药研究所，上海 200233)

桑葚，为桑科植物桑的果穗，富含膳食纤维、多种有机酸、7种维生素、16种人类所需微量元素、氨基酸、白藜芦醇等营养成分，号称“天然富硒水果皇后”。桑葚是国家卫生部首批公布的药食同源的植物品种之一，不仅具有丰富的营养价值，更具有保健功能[1-3]。《本草纲目》中记载：“桑葚，止消渴，利五脏关节，通血气，令人聪明”。现代医学研究表明，桑葚具有利尿排毒、调节机体免疫力、缓解眼睛疲劳、美容养颜、延缓衰老等多种功效[2]。

益生菌是一类能在人类及动物肠道内定殖，能够抑制致病菌生长，改善宿主微生态平衡的有益微生物，具有提高机体免疫力、改善乳糖不耐症、预防食物过敏、降低血脂和保护肝脏等保健功能[4-7]，长期用于乳制品中，如酸奶、开菲尔乳和各种乳饮料为主要代表。近年来，随着消费者对于低脂、低糖、不含胆固醇饮食的日益关注，采用益生菌发酵的果蔬汁饮料产品受到消费者青睐，这类产品不仅富含矿物质、维生素、膳食纤维和抗氧化物质，更增添了多种功能因子，且具有独特的发酵风味和口感。

笔者以桑葚汁为主要原料，优选益生菌发酵菌株，通过单因素试验以及正交试验等方法，优化产品发酵工艺条件，开发出一款“天然、营养、美味、保健”的活性乳酸菌桑葚汁饮料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1原材料。浓缩桑葚汁(42.0 BX)，福建绿全食品有限公司；蔗糖，市售；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP-Onlly)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei，LPC-Onlly)，上海交大昂立股份有限公司生物医药研究所保存。

1.1.2培养基。MRS液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉8 g，酵母浸粉4 g,葡萄糖20 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢二胺2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04 g，吐温-80 1 g，蒸馏水1 L。调节pH为6.0～6.2，121 ℃灭菌15 min。

1.1.3仪器与设备。立式压力蒸汽灭菌器BXM-30R，上海博讯实业有限公司；PYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；洁净工作台，上海汇龙仪表电子有限责任公司；AR1502CN精密电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2方法

1.2.1发酵剂的制备。

1.2.1.1菌株的活化。将-20 ℃冷冻保藏的植物乳杆菌LP-Onlly、副干酪乳杆菌LPC-Onlly甘油管解冻至室温，在超净工作台无菌条件下分别将500 μL菌种接种至15 mL MRS液体培养基中，37 ℃下培养箱中培养18～24 h。按照此法反复活化3代，获得活力较好的菌种。

1.2.1.2发酵剂的制备。将上述活化好的植物乳杆菌LP-Onlly、副干酪乳杆菌LPC-Onlly菌种分别加入MRS液体培养基中37 ℃下培养箱中培养18～24 h，获得发酵用菌种，其活菌数大于1.0×109CFU/mL。

1.2.2工艺流程。浓缩桑葚汁→稀释→调节pH→调配→灭菌→冷却→接种→发酵→成品冷藏。

其操作要点主要如下：浓缩汁采用纯净水按复原比例进行稀释，用NaHCO3将桑葚汁pH调节为5.0～5.5[8]，加入蔗糖、蜂蜜、低聚果糖、低聚异麦芽糖等进行调配，采用高压蒸汽法进行灭菌，温度为105 ℃，时间为10 min。冷却后接种一定量的发酵菌种，在37 ℃下进行发酵，达到发酵终点时停止发酵，即为成品，在冷库中进行冷藏。

1.2.3乳酸菌活菌计数。对乳酸菌活菌进行测定，无菌条件下将样品梯度稀释不同浓度，采用平板计数法[9]，选择菌落在30～300个的平板菌落总数进行计数。

1.2.4发酵桑葚汁的感官评价。由10名不同年龄、性别的人员组成评定小组，从发酵产品的色泽、气味、口感等方面综合进行评定，满分为10分，取平均分进行评定[10]。发酵桑葚汁感官评价标准见表1。

表1发酵桑葚汁感官评价标准

Table1Sensoryevaluationcriteriaforfermentedmulberryjuice

项目Item评分标准Evaluationstandards分数Score分色泽Colorandlustre色泽鲜亮，红棕色3气味Smell果香味浓郁，发酵风味较好，无异味3口感Texture酸甜可口，柔和适宜4

1.2.5发酵桑葚汁货架期的预测。将发酵好的桑葚汁放入0～4 ℃的冰箱中进行冷藏，每隔7 d取样测定活菌总数及pH的变化，确定发酵桑葚汁饮料的货架期。

1.3发酵桑葚汁制作工艺的单因素试验以桑葚汁添加量为50%，蔗糖添加量为5%、2种乳酸菌1∶1混合后接种量为3‰，发酵温度为37 ℃，发酵时间为16 h作为基础试验，改变桑葚汁的添加量20%、30%、40%、50%、60%，蔗糖的添加量1%、3%、5%、7%、9%，发酵时间12、16、20、24、28 h，乳酸菌接种量1‰、3‰、6‰、9‰、12‰，按照“1.2.2”工艺流程发酵桑葚汁，然后根据表1进行感官评价。

1.4发酵桑葚汁工艺的正交试验通过单因素试验，确定了以桑葚汁添加量、蔗糖的添加量、乳酸菌种的接种量、发酵时间进行4因素3水平正交试验，根据感官评价来确定最佳发酵配方。

2 结果与分析

2.1发酵桑葚汁工艺研究的单因素试验

2.1.1桑葚汁添加量对发酵桑葚汁感观评价的影响。为了使发酵桑葚汁具有理想的色泽、口感，首先对桑葚汁的添加量进行优化。在桑葚汁浓度分别选用20%、30%、40%、50%、60%，在基础试验上考察其对发酵的影响，然后比较发酵后的不同桑葚汁浓度的口感、色泽、风味，确定最佳的果汁添加含量，结果如表2所示。由表2可见，桑葚汁最适添加量范围在40%～60%。

表2 桑葚汁不同添加量时发酵果汁的感官评价

2.1.2蔗糖添加量对发酵桑葚汁感观评价的影响。蔗糖含量较低时，营养不充足，不利于乳酸菌的增殖；当蔗糖浓度过高时，则会抑制乳酸菌的生长。考察添加蔗糖含量为1%、3%、5%、7%、9%，对不同蔗糖含量的发酵桑葚汁进行感官评价。结果如图1,可以看出蔗糖添加量最佳范围在3%～7%。

图1 蔗糖添加量对发酵桑葚汁感官评价的影响Fig.1Sensory evaluations on the fermented mulberry juice with different concentrations of sucrose

2.1.3发酵时间对发酵桑葚汁感观评价的影响。桑葚汁添加量为50%，蔗糖添加量为5%，2种乳酸菌1∶1混合后接种量为3‰，发酵时间分别为12、16、20、24、28 h。对不同发酵时间的发酵桑葚汁进行感官评价，结果如图2。由图2可见，最佳发酵时间为16～24 h。

图2 发酵时间对发酵桑葚汁感官评价的影响Fig.2 Sensory evaluation on the fermented mulberry juice with different fermentation time

2.1.4接种量对发酵桑葚汁感观评价的影响。将植物乳杆菌、副干酪乳杆菌2种乳酸菌1∶1混合，分别按照1‰、3‰、5‰、7‰、9‰的比例接种于桑葚汁添加量为50%、蔗糖添加量为5%的基质中，发酵温度为37 ℃，时间为16 h，每隔4 h测定桑葚汁的pH。分别对上述不同比例接种量所发酵的桑葚汁进行感官评价。如图3所示，可以看出接种量浓度较低和较高时，对发酵风味影响较大。其原因主要是当接种量少时，发酵速度较慢，风味物质形成较少；当接种量大时，较难控制发酵速度，发酵产品容易偏酸，且发酵风味过于浓郁，影响口感。因此，最适接种量为3‰～7‰。

图3 接种量对发酵桑葚汁感官评价的影响Fig.3 Sensory evaluation on the fermented mulberry juice with different inoculation

2.2发酵桑葚汁工艺正交试验通过上述单因素试验对感官评分结果的影响，选择了桑葚汁添加量、蔗糖添加量、发酵时间、接种量4个因素进行3水平正交试验。正交试验因素水平设计见表3，试验结果见表4。

表3 桑葚汁发酵工艺因素水平设计

由表4中的极差R值可以看出，影响桑葚汁发酵因素主次顺序为：桑葚汁添加量(A)>蔗糖添加量(B)>接种量(D)>发酵时间(C)。由表4中的K值可知，优化方案为A2B2D1C3即桑葚汁添加量为50%，蔗糖添加量为5%，发酵时间为24 h，接种量为3‰。经过进一步验证，在最优条件下，发酵桑葚汁酸甜可口，pH为4.1，综合评价其色泽、口感、风味为最佳。

2.3发酵桑葚汁在储藏过程中乳酸菌的变化发酵桑葚汁在0～4 ℃温度下冷藏28 d，每7 d定期测定其活菌数，测定结果见图4。

由图4可以看出，在冷藏环境下(0～4 ℃)贮藏28 d过程中乳酸菌活菌数逐渐减少，这是因为在冷藏条件下，乳酸菌进行了缓慢的发酵，营养物质逐渐消耗，乳酸菌生长进入了衰亡期，活菌缓慢减少。但是由于发酵结束后桑葚汁中初始乳酸菌活菌为7.8×108CFU/mL，冷藏28 d后活菌数依然较多，为2.1×108CFU/mL，远远大于1.0×106CFU/mL。

表4发酵桑葚汁正交试验结果

Table4Theresultsoforthogonaltestforthefermentedmulberryjuice

试验号TestNo．因素FactorABCD感官评价Sensoryevaluation分111117．3212227．6313337．1421238．2522318．8623128．1731327．5832137．8933217．4K17．3337．6677．7337．833K28．3678．0677．7337．733K37．5677．5337．8007．700极差Range1．0340．5340．0670．133

图4 发酵桑葚汁在冷藏过程中乳酸菌活菌变化Fig.4 Changes of viable bacteria of lactic acid bacteria in fermented mulberry juice during cold storage

3 结论

该研究利用植物乳杆菌、副干酪乳杆菌2种常见益生乳酸菌混合后进行桑葚汁饮料的发酵，通过采用正交试验方法优化了发酵工艺的参数条件，并对发酵成品进行了货架期预测。通过正交试验设计，得到最优的发酵工艺条件：桑葚汁添加量为50%，蔗糖添加量为5%，发酵时间为24 h，接种量为3‰，发酵温度为37 ℃。在最优条件下发酵的桑葚汁饮料具有鲜亮的红棕色，带有桑葚的果香味并兼具发酵风味，酸甜可口。发酵桑葚汁经过28 d冷藏后，乳酸菌活菌数2.1×108CFU/mL，仍处于较高浓度。

目前国内市场上真正意义上的含有活菌的发酵果汁很少见，多是原浆发酵后灭活勾兑产品，该研究所研制的活性乳酸菌桑葚汁饮料兼具营养、保健功能，具有广阔的市场前景，同时也可以为相关活菌型发酵果汁提供一定的参考。

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