有机硒对断奶羔羊十二指肠形态学及血清GSH—Px活性的影响

海小亮

摘 要：为了研究有机硒饲料对断奶羔羊十二指肠组织形态结构及血清GSH-Px活性的影响，选择体重、生理状态相近及健康的本地断奶羔羊18只作为试验动物，随机分为2组，试验羊均编号，每组9只，一组在基础日粮中按体重添加0.3mg/kg有机硒，另一组添加0.3mg/kg无机硒。预饲期10天，正试期饲喂60d左右。饲喂试验结束后将绵羊屠宰，取十二指肠接近幽门部位的组织样，采用常规的石蜡切片HE染色方法制作切片，通过显微测微尺的方法测定断奶羔羊绒毛高度、隐窝深度；并采集饲喂试验前后羊血，应用谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒测定羊血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果表明，有机硒组断奶羔羊的十二指肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值均为显著高于无机硒组断奶羔羊（P<0.05），有机硒组断奶羔羊隐窝深度稍低于于无机硒组断奶羔羊，但差异不显著（p>0.05）。饲喂硒添加饲料后，有机硒组断奶羔羊血清GSH-Px活性较无机硒组变化显著（p<0.01）。结论：日粮中添加有机硒饲料可以促进断奶羔羊小肠的发育，可以提高断奶羔羊血清抗氧化酶活性。

关键词：有机硒；断奶羔羊；絨毛高度；隐窝深度；GSH-Px活性

硒作为动物体的必需微量元素，被广泛用于畜禽企业，主要也用来防止动物缺硒而产生的问题，以及对维持动物正常的生长发育和黏膜兔疫功能有重要的作用。同时，硒是一种抗氧化作用的元素，具有保护细胞膜的完整性的作用。硒作为动物体的必需微量元素，主要在动物的小肠位置吸收，有人研究过硒可以直接参与免疫功能，在黏膜免疫上有促进的作用，也有研究者利用小鼠进行胃肠外加硒试验，说明了硒在动物营养上对小肠结构有维护的功能。然而，硒在断奶羔羊的肠道形态结构上会不会有明显作用，目前缺乏相关的报道，不过有研究显示有机硒的作用比无机硒对动物有利。本试验通过给断奶羔羊添加有机硒和无机硒，观察断奶羔羊十二指肠形态结构和血液抗氧化酶活性是否有变化，为有机硒在断奶羔羊饲料中的添加等提供理论依据。

一、 材料与方法

1.试验材料

（1）试验动物。体重、生理状态相近及健康的本地断奶羔羊18只，来源于同心县德瑞牧业有限公司。

（2）饲喂饲料。

有机硒添加：基础日粮中添加由宁夏农科院配制成的酵母硒。

无机硒添加：在基础日粮中添加亚硒酸钠（Na2SeO3）。

（3） 主要试剂及仪器。乙醇、甲醛、二甲苯、石蜡、中性树胶（产品批号：20160525；生产厂家：上海华申康复器材有限公司）、苏木精（产品批号：20160915；生产厂家：上海中秦化学试剂有限公司）、伊红（产品批号：20161015；生产厂家：天津市凯信化学工业有限公司）、GSH-Px试剂盒（南京建成生物工程研究所）等。石蜡切片机（型号：QP-3268；厂家；武汉器械有限公司）或冰冻切片机、恒温蜡箱（型号：DGG-9076AD；厂家：德州市昊诚实验仪器有限公司）、熔蜡缸、电热恒温水浴锅（型号：单孔DK-98-II；厂家：上海析域仪器设备有限公司）、显微镜（型号：RW-200116DIC；厂家：产于日本）、紫光分光光度计（上海）、离心机等。载玻片、盖玻片等实验室消耗品，刀、剪等解剖器械。

2.试验方法

（1）试验动物分组。将选好的18只断奶羔羊，随机分为2组，一组饲喂日粮中按体重添加0.3mg/kg酵母硒，另一组饲喂日粮中按体重添加0.3mg/kg亚硒酸钠，试验羊只均编号入舍，分槽饲养。

（2） 饲养管理。试验羊只进入圈舍前7天，用0.2%新洁尔灭溶液将舍内地面、门窗、墙壁、水料槽进行彻底消毒。预饲期前对试验羊进行驱虫、健胃及防疫。用抗蠕敏进行体内驱虫3天；之后口服大黄苏打片进行健胃，连服3天。试验羊只每天分两次饲喂（早6：30、晚17：30），自由饮水。预饲期10天，正试期2个月，观察羊的活动、精神及健康状况等，并从正试期起开始记录每天给料量和采食量。

（3）样品采集。

①血液样品采集。在试验第1d和60d在早晨，进行静脉采血，收集血液，分离血清，至于-20℃低温冰箱里冻存备用。

②组织样品采集。饲喂结束后将断奶羔羊行屠宰（屠宰前禁食12小时），屠宰后立即打开腹腔，迅速采集十二指肠接近幽门部组织样品，放入10%中性福尔马林固定液中固定。

（4） 石蜡切片制作及HE染色。利用组织学常规的石蜡切片HE染色的方法进行操作。其制作过程主要包括：取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→染色→透明→封片等。首先，对采取的组织样进行编号，并修整组织块大小为1cm。将组织块放入流水中冲洗12小时；再用由低到高浓度梯度酒精进行脱水；在配制比例为1：1的无水乙醇与二甲苯进行透明，再次经过二甲苯透明组织样，时间根据组织块大小而定，总时间不宜超过2小时；然后，进入浸蜡和包埋阶段。根据石蜡的熔点（50～65℃），将蜡融化依次与二甲苯不同比例混合及纯石蜡，将经过透明的组织块置于恒温条件下，按以上配制的石蜡液进行浸蜡，一般每次所需时间30分钟左右。包埋中，先准备好纸盒、包埋框或底模，将熔蜡倒入纸盒、包埋框或底模中，迅速用欲温的镊子夹取组织块平放在纸盒、包埋框或底模底部，摆好位置，盖好包埋盒，并使其迅速冷却凝固。最后，进行组织蜡块的切片和贴片。调节好切片机后，连续切片、间隔取片，切去约为5um的厚度。将切取好的切片放在欲温的水面上展平后，用载玻片倾斜入水面捞取切片，而后，放在36℃温箱内烘干12小时左右。

石蜡切片HE染色步骤：脱蜡→复水→苏木精染色→分色→水洗蓝化→蒸馏水短洗→一伊红染色→脱水→脱色（分色）→透明→封片。

（5） 显微镜下观察及数据测定。光镜下，详细观察和比较十二指肠形态结构的变化情况，每张切片选取5个区域的肠绒毛高度、隐窝深度。绒毛高度是从绒毛顶端到肠腺窝的距离进行测量，隐窝深度是从隐窝处至隐窝底层，接近黏膜下层的距离进行测定，此过程利用的工具为显微测微尺。

（6）断奶羔羊血清GSH-Px活性的测定。使用南京建成生物工程研究所提供的試剂盒，采用二硫代硝基苯甲酸法（DTNA法）。测定方法参考说明书。最后，计算出其活性值。

（7）数据分析。应用Excel软件记录试验数据，用SPSS软件进行统计和方差分析，得出的实验数据结果用平均数 标准差（ S）表示，P表示显著性。

二、结果与分析

试验过程中两组羊只的精神、健康状况、生产性能良好。

低倍镜下，十二指肠壁由内向外分别为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜四层结构组成。黏膜面上有许多皱襞以及许多指状突起即肠绒毛，它是由黏膜上皮和固有膜向肠腔面突起形成。黏膜固有层由疏松的结缔组织构成，含有大量小肠腺（肠隐窝）。黏膜下层内的腺体称为十二指肠肠腺。

高倍镜下观察肠绒毛，绒毛表明被覆有单层柱状上皮。上皮细胞主要吸收细胞（柱状细胞）和少量的杯状细胞组成。吸收细胞外表面有红色的刷状缘。在绒毛中央，富含网状纤维的结缔组织固有层，一部分突进绒毛的轴心，另一部分位于肠腺之间。

三、讨论

1.关于样品采集位置的决定

硒是一种非金属量性元素，由Berzelius首次发现并命名，自从1957年Schware等人首次发现硒对动物其到有益的作用，并且证明人和动物体内必需的微量元素。吴金学（2016）在谈论微量元素硒与羊营养的关系中提到，动物对硒的吸收都在十二指肠中进行，羊的瘤胃或真胃不进行硒的吸收，吸收的硒，大部分进入血液，随血液循环到各组织，主要集中于肾、肝、胰和脾。故此，本实验采集断奶羔羊十二指肠组织进行实验研究。

2.关于硒对十二指肠结构的影响

小肠的正常结构的完整与功能的健全能够充分消化和吸收营养物质，特别是小肠的肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度及绒毛表面积是衡量小肠消化吸收功能的重要指标[5，6]。李芳等（1996）指出硒可以促进结肠黏膜损伤的恢复。林玉才（2010）通过研究得出硒缺乏能不同程度上降低雏鸡肠道黏膜厚度、肌层厚度、绒毛长度和宽度、隐窝深度，而十二指肠降低明显。路则庆（2014）结果指出断奶仔猪日粮中添加Z0206富硒多糖可以改善肠道结构、显著提高了十二指肠绒毛高度和隐窝深度比值，十二指肠绒毛高度有所增加。相关研究表明[10，11]，肠道黏膜结构的完整，能够增强动物的消化吸收功能，对于绒毛高度与隐窝深度比值的下降，其黏膜受损，影响肠道消化吸收功能，对动物的生长发育不利。本实验中，添加有机硒组的断奶羔羊十二指肠绒毛形态结构较无机硒组断奶羔羊有明显区别，其绒毛高度、结构完整及排列整齐上均处于较好的结果。试验不足之处是，没有从硒水平角度进行研究，不能说明硒含量与羊肠道之间的关系，但也有试验指出，动物摄入硒过量引发硒中毒，这里有关断奶羔羊在该日粮添加下有机硒的最适添加量还有待进一步研究。

四、 结语

断奶羔羊日粮添加有机硒，可显著促进小肠绒毛、隐窝等结构的发育，提高断奶羔羊的消化吸收机能，而且有机硒对断奶羔羊血清谷胱甘肽过氧化物酶活性的增强效果比无机硒的明显。有机硒可以作为羊生产中的首选添加剂，对预防缺硒病是很有必要的，对动物自身健康的发展和硒在畜牧养殖业上的应用起到更有价值的作用。

参考文献：

[1] 段得贤 . 家畜内科学 . 化京：农业出版社，1981：327.

[2] 梁礼成，李庆怀，余久沂，等.硒时肉鸡免疫功能的增强作用.北京农业大学学报，1993；19（2）；99-103.