没食子提取物体内外抗炎作用研究

美热古丽·依米提 窦勤 李治建 斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 研究没食子提取物体内外抗炎作用。 方法 体内以二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀实验观察其抗炎作用；体外观察没食子提取物对RAW264.7细胞生长曲线和活力以及吞噬中性红能力的影响；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测没食子提取物对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。 结果 与模型组比较，没食子提取物能显著减轻小鼠的耳肿胀度和足趾肿胀（P < 0.05或P < 0.01）；20、40 μg/mL没食子提取物能活化RAW264.7巨噬细胞，促进RAW264.7细胞增殖，并能增强其吞噬功能；25、50 μg/mL没食子提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α有明显的抑制作用（P < 0.01）。 结论 没食子提取物具有一定的抗炎作用，可能與抑制促炎介质TNF-α的分泌有关。

[关键词] 没食子提取物；抗炎作用；RAW264.7细胞；肿瘤坏死因子α

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（c）-0008-06

[Abstract] Objective To study the anti-inflammatory effects of Turkish galls extract in vivo and in vitro. Methods The anti-inflammatory effects in vivo were observed through the experiments of mice ear swelling induced by xylene and rats toe swelling induced by carrageenan； the effects of Turkish galls extract for the growth curve and vitality of RAW264.7 cells and phagocytosis of neutral red were observed in vitro； the effects of Turkish galls extract for the secretion of tumor necrosis factor α （TNF-α） in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide （LPS） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with model group， Turkish galls extract could significantly reduce the degree of ear swelling and toe swelling （P < 0.05 or P < 0.01）. 20， 40 μg/mL of Turkish galls extract could activate RAW264.7 macrophages， the proliferation of RAW264.7 cells was promoted and their phagocytosis was enhanced. 25， 50 μg/mL of Turkish galls extract had significant inhibitory effects for the secretion of TNF-α in RAW264.7 cells stimulated by LPS （P < 0.01）. Conclusion Turkish galls extract has certain anti-inflammatory effects， which may be related to the inhibition of secretion of pro-inflammatory mediator TNF-α.

[Key words] Turkish galls extract； Anti-inflammatory effects； RAW264.7 cells； Tumor necrosis factor α

没食子是没食子蜂科昆虫没食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.的幼虫，寄生于壳斗科植物没食子树Quercus infectoria Oliv.幼枝上所产成的虫瘿。没食子性寒，味苦涩，具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎的作用[1-2]，是维吾尔医常用药材，具有健齿固龈、清血止血、消炎和防腐之功效，被用于治疗溃疡性结肠炎、口腔溃疡等疾病，疗效显著，临床上其具有明显的抗炎、镇痛作用[3-4]。药理学研究表明，没食子具有提高机体非特异性免疫功能，清除自由基和抑制脂质过氧化损伤等作用[3-4]。但其系统的抗炎作用报道较少，本实验通过研究没食子提取物的体内外抗炎实验，体内试验观察没食子提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响，体外试验观察没食子提取物对RAW264.7细胞生长曲线和活力以及吞噬中性红能力的影响；进一步观察采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测没食子提取物对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响，探讨其抗炎作用机制，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品

没食子水提物（批号：20161112），药材购自新疆奇康哈博维药有限责任公司。由新疆维吾尔医药研究所希尔艾力主任药师鉴定为正品。提取方法：取没食子，粉碎成粗粉，加8倍量水浸泡1 h后，煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，滤过，滤液真空干燥得浸膏，称重，得率为75%。

地塞米松（濮阳市汇元药业有限公司，批号：090603）；吲哚美辛片（开封永康药业有限公司，批号：20090409）。

1.2 试剂

二甲苯（天津市红岩化学试剂厂，批号：200910107）；角叉菜胶（BIO BASIC INC，批号：GS0622b509L）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津市光复精细化工研究所，批号：20081021）；DMEM培养基（高糖，含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，美国GIBCO公司，Exp：12/2010）；PBS（上海生工，Lot：0928P14）；胎牛血清（HYCLONE，美国，Lot：NUK00138）；胰蛋白酶（trypsin，美国Sigma公司，Exp：08/2011）；二甲基亚砜（DMSO，天津市永晟精细化工有限公司，Lot：20070225）；碳酸氢钠（NaHCO3，上海晶美試剂公司，Lot：20090506）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，Lot：20080821）；培养板（96孔板，美国Costar公司）；小鼠ELISA TNF-α试剂盒（南京建成生物工程研究所，Lot：201006）；LPS（Sigma公司，Exp：201208）。

1.3 动物

昆明小鼠，SPF级，体重（20±2）g，25 d，新疆实验动物研究中心提供，雌雄各半；SD大鼠，SPF级，180～220 g，45 d，雄，新疆实验动物研究中心提供，SCXK（新）2011-0002。实验动物喂养环境：动物在新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所SPF级动物房。饲养于塑料笼内，每笼饲养性动物不多于5只，自由饮水，摄食。室温：20～26℃，相对湿度：40%～70%，光照12 h，实验开始前经一般观察。

1.4 细胞株

RAW264.7细胞，购自上海细胞库。

1.5 主要仪器

XD-101倒置显微镜（日本）；BIORAD 550酶标仪（美国）；CO2恒温培养箱（SANYAO）；37XB型倒置显微镜（上海光学六厂）；GBC紫外可见分光光度计；MCO-175 CO2培养箱（日本，Sanyao）。

1.6 方法

1.6.1 体内抗炎试验

1.6.1.1 没食子提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀影响

SD大鼠72只，体重180～220 g，按照体重分层法随机分为模型组、吲哚美辛组（7.5 mg/kg）和没食子高、中、低剂量组（100、50、25 mg/kg），每组12只。模型组给予等体积的0.5% CMC-Na溶液灌胃给药，其他组分别灌胃给药，每天1次，共7 d。给药前以数显卡尺测定各组右后足厚度，给药后0.5 h，各鼠在右后足跖中部皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL。致炎后1、2、3、4 h测定右后足厚度，计算肿胀度、肿胀率。4 h后处死，将致炎足自踝关节上0.5 cm处剪下，称重。肿胀度=右耳片重量-左耳片重量；肿胀率=肿胀度/左耳片重量×100%。

1.6.1.2 没食子提取物对小鼠耳肿胀的影响

昆明种雄性小鼠60只，体重18～22 g，按照体重分层法随机分成五组，每组12只，即模型组、地塞米松组和没食子高、中、低剂量组。地塞米松组以5 mg/kg灌胃给药；没食子高、中、低剂量组分别以120、60、30 mg/kg灌胃给药；模型组给予等体积的0.5% CMC-Na溶液，每天1次。第3天给药1 h后，乙醚麻醉小鼠，每只小鼠右耳正背面以微量移液器滴涂100%二甲苯致炎，0.02 mL/只，左耳不作处理，1 h后颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径为7 mm的打孔器在同一部位打下圆耳片，称重，计算肿胀度、肿胀率。肿胀度=右耳片重量-左耳片重量，肿胀率=肿胀度/左耳片重量×100%。

1.6.2 体外抗炎试验

1.6.2.1 没食子提取物对RAW264.7细胞活力的影响

1.6.2.1.1 MTT法测定没食子提取物对RAW264.7细胞活力的影响 细胞消化后计数，用培养液稀释调整为1×104～8×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，12 h待细胞完全贴壁后，分为两组，每个浓度2个复孔，给药组（没食子提取物）加入终浓度为25 μg/mL，空白对照组加等体积的培养液，在加药后的1、2、3、4、5、6、7 d测结果，测定前每孔加100 μL（5 mg/mL）的MTT，继续培养4 h，弃上清液，加DMSO 1 mL/孔，吹打使甲臜颗粒充分溶解。吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长490 nm，绘制细胞生长曲线。

1.6.2.1.2 MTT法测定没食子对LPS刺激RAW264.7细胞活力的影响 细胞消化后计数，用培养液稀释调整为1×104～8×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，12 h待细胞完全贴壁后，分为四组，没食子提取物组加入没食子提取物+LPS终浓度为25 μg/mL，LPS组加10 μg/mL的LPS 10 μL，地塞米松+LPS组加10-7 mmol/mL地塞米松100 μL。空白对照组加等体积的培养液，在加药后的1、2、3、4、5、6、7 d测结果，绘制细胞生长曲线。

1.6.2.1.3 对RAW264.7细胞增殖和吞噬功能的影响 RAW264.7细胞株用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，调整细胞密度为1×105个/mL（增殖实验浓度为1×106个/mL），接种于96孔细胞培养板37℃、体积分数5%CO2培养箱培养6 h后，没食子浓度为100、50、25、12.5 μg/mL（增殖实验设浓度为5、10、20、40、80 μg/mL，加药培养1 h后除空白组其他各孔加10 μg/L的LPS），加药后置培养箱中培养24 h后，弃上清液，加0.075%中性红溶液，100 μL/孔，培养30 min后，以PBS洗3次，加醋酸-乙醇（1∶1）细胞溶解液，100 mL/孔，于4℃静置过夜，用酶标仪在570 nm波长处测OD值。

1.6.2.2 没食子提取物对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

培养液为含10%胎牛血清高糖DMEM培养条件为37℃，5%CO2，相对饱和湿度。体外培养RAW264.7细胞到对数生长期，胰酶消化调节细胞浓度1×105个/mL加入到24孔板中，培养12 h后细胞贴壁，分别加入50、25、12.5 μg/mL的没食子提取物，阳性对照组加10-7 mmol/mL的地塞米松，1 h后除空白组其他各孔加1 μg/mL的LPS，24 h后取上清液进行测定。细胞上清液1000×g离心10 min去除颗粒和聚合物。严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）：先进行各组总体比较，若差异无统计学意义则判定各组之间差异无统计学意义；否则继续进行给药组和对照组之间的多对一比较，根据方差齐性检验结果，方差齐使用LSD法，方差不齐使用Tamhane's T2法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体内抗炎试验

2.1.1 没食子提取物对小鼠耳肿胀的影响

地塞米松组、没食子低剂量组和高剂量组均可抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀。与模型组比较，地塞米松组肿胀度和肿胀率明显降低（P < 0.01或P < 0.05）；没食子低、高剂量组肿胀度明显降低（均P < 0.05）。见表1。

2.1.2 没食子提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀影响结果

与模型组比较，吲哚美辛组在1～4 h时均可以抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀（P < 0.01）；没食子中、低剂量组在1 h时可以抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀（P < 0.05）。见表2。

2.2 体外抗炎试验

2.2.1 没食子提取物对RAW264.7细胞形态学的影响

对照组的RAW264.7细胞均匀分布，形态呈梭形或多角形，贴壁牢固，透明度高，形态正常，折光性强，核分裂相对较多，生长旺盛。与对照组比较，没食子提取物作用后形态无差别但部分细胞可见体积变大较多，核分裂较多。LPS组与正常细胞组比较细胞伪足增多，胞体变大。没食子+LPS组RAW264.7细胞部分皱缩，体积变小，核分裂相较少，聚集成团，折光性差，胞浆内可见大量黑色颗粒，透明度显著下降，部分漂浮于培养液中，细胞肿胀，部分细胞膜破裂，表明细胞已经坏死。见图1。

2.2.2 不同药物对RAW264.7细胞生长曲线的影响

随着药物作用时间的延长，不同药物对RAW264.7细胞增殖速度有明显差异。正常细胞生长曲线在贴壁24 h细胞潜伏期过后，在2～5 d细胞进入对数生长期，细胞生长加快，在第5～6天细胞进入平台期（图2A）。没食子干预后，细胞生长加快（24～72 h），在第4天细胞开始出现进入平台期，细胞活性减弱，7 d（图2B）后生长受到抑制。没食子+LPS干预细胞，培养1～5 d（图2C），細胞在第4天生长均受到抑制，细胞活力和增殖能力较正常细胞下降。

2.2.3 没食子提取物对RAW264.7细胞增殖的影响

从表3中可知，与LPS共同刺激的没食子提取物20、40 μg/mL组有显著的增殖作用（P < 0.05），增殖率分别为115.28%和114.89%，80 μg/mL的没食子作用后没有明显的增殖作用。未加LPS组，40、80 μg/mL没食子提取物对RAW264.7细胞的增殖率都达到130%以上，并且在5～80 μg/mL范围内没食子各剂量组对RAW264.7细胞有明显促进增殖作用（P < 0.05或P < 0.01），呈一定的浓度依赖性。

2.2.4 没食子提取物对RAW264.7细胞吞噬功能的影响

与空白组TNF-α含量[（57.53±11.31）ng/mL]比较，LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α含量[（76.87±20.74）ng/mL]明显升高（P < 0.05）；与LPS组比较，没食子25、50 μg/mL组对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α升高具有明显降低作用[没食子25 μg/mL组：（48.75±19.80）ng/mL；没食子50 μg/mL组：（36.53±0.47）ng/mL]（P < 0.01），呈明显的剂量相关性。

3 讨论

没食子含没食子含有鞣质50%～70%、没食子酸2%～4%及并没食子酸[4]、树脂等。鞣质味涩，具有收敛、抗炎、镇痛、调节免疫、降血脂、降血糖[5-20]等作用，维吾尔医临床上常用没食子治疗或缓解溃疡性结肠炎，以及治疗口腔溃疡的炎症[21-23]。RAW264细胞是致炎性生物的主要来源之一，包括TNF-α、白介素-6（IL-6）。LPS诱导RAW264细胞释放TNF-α、IL-6等炎症因子[24-25]。本研究结果显示，没食子提取物能抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀；在没食子提取物的干预下RAW264.7细胞在1～4 d生长明显加快，干预第4天细胞开始出现进入平台期，说明没食子提取物对RAW264.7细胞的增殖能力由促进转为抑制。在LPS干预下，细胞在1～4 d对数生长期停止生长进入平台期，没食子提取物和LPS同时干预细胞，随着作用时间的延长，细胞增殖受到抑制。没食子与LPS共同作用细胞后对细胞增殖影响不明显，单独作用细胞可促进细胞生长，但随作用时间的延长由增殖转为抑制。RAW264.7细胞属单核/巨噬细胞系，在外源活性物质刺激后，其吞噬率及吞噬速度增高，杀菌、杀瘤能力分泌活性及抗原呈递能力也增强。由没食子提取物与RAW264.7增殖、吞噬的关系发现，其一方面能明显促进细胞增殖能力和生存能力，具有活化巨噬细胞的作用；另一方面对LPS刺激活化的细胞增殖能力并没有明显的促进作用，但是对其吞噬功能有一定的增强作用，从而发挥着双向调节的作用。没食子提取物对RAW264.7细胞有明显促进增殖和吞噬功能的作用，能抑制LPS刺激细胞分泌TNF-α，提高巨噬细胞功能，减少内毒素诱导的巨噬细胞致炎细胞因子的释放，从而减轻患者痛苦。

综上所述，没食子提取物具有一定的抗炎作用，可通过抑制促炎介质TNF-α的分泌起到抗炎作用。

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（收稿日期：2017-10-10 本文编辑：张瑜杰）