抗生素体外及体内抑菌效应检测的实验综述报告

商飞　于鲁敏　薛挺

【摘 要】本实验通过抗生素在体外和体内抑制金黄色葡萄球菌生长实验阐述了其实验目的、实验原理、实验步骤以及数据处理和实验注意事项。此外，梯度稀释法、纸片法以及稀释涂平板等基础的实验操作是从事微生物科学研究的初级工作人员必须掌握的实验技能。

【关键词】抑菌；抗生素

中图分类号： S336 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）06-0086-002

1 实验意义

本综合实验项目作为微生物学实验的补充和深入，选择抗生素为实验材料，主要内容包括抗生素的体外抑菌实验、抗生素的体内抗菌实验，形成一个整体的综合性实验。在实验内容上强调系统性、专业性、实用性和趣味性；涉及微生物学专业多项技术原理、复杂流程，将整体实验课程的水平从分散的基础实验提升到综合性、系统性更高的层次，对学生的动手能力、专业水平、科研素质等进行全面的培养和提高，此即本项目设计的意义所在。

2 实验目的

（1）了解常用抗菌药物的抗菌作用及抗菌范围，并掌握抗菌药物的某些体外抗菌实验；

（2）观察血液、细菌、药物三者相互作用，以加深学生对抗菌药物药理作用的认识；

（3）通过理论联系实际的学习和操作训练，训练学生掌握医学微生物学综合实验技能和实验技巧，提高动手能力，有助于学生科学世界观的形成；

（4）培养学生独立操作、分析解决问题的能力，提高对微生物学的兴趣，为学生独立创业提供一些创业技能思路。

3 实验原理

金黄色葡萄球菌是机会致病菌，而抗菌药物在一定浓度下对其有抑制和杀灭作用。抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。

药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。

稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用？滋g/mL或U/mL表示。其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。

琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。

药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可以形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收、分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抑菌实验外还需要做体内的抗菌实验。

4 实验操作

4.1 实验材料与用品

材料：宿主（兔、鸡等）经抗凝处理后血液全血组分，人工培养的人单核巨噬细胞U937，金黄色葡萄球菌209-P（或NCTC8325）标准株。

器材：灭菌EP管（EP管），EP管架，新鲜全血，枪头（黄、白、蓝），微量移液器（10？滋L，100？滋L，1mL），灭菌小棉签，小镊子，圆形滤纸（直径为6 mm），培养皿，紫外分光光度计，电热恒温培养箱，恒温振荡培养，细胞培养板。

药品与试剂：青霉素，链霉素，四环素，氯霉素，红霉素，碘酊，柠檬酸钠，75%酒精，PBS缓冲液。

4.2 培养基的制备

（1）TSB+agar培养基：胰蛋白大豆肉汤粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，琼脂20.0g，溶化后分装，121℃灭菌15min备用。

（2）TSB肉汤培养基：胰蛋白大豆肉汤粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃灭菌15min备用。

4.3 抗菌药物的体外抑菌实验

4.3.1 试管法

（1）取灭菌EP管10只，按1-10编号，排列于EP管架上。无菌操作，分别加入TSB肉汤培养基0.5mL。用微量移液器吸取40U/mL的青霉素药液0.5mL放入第1管，并反复吸匀。从第1管吸出0.5mL放入第2管，吸匀后吸出0.5mL放入第3管，依此法逐管进行稀释至第9管。第10管不加药液作为对照管。

（2）各EP管加入0.5mL新鲜配置的稀释浓度为10-4的金黄色葡萄球菌209-P菌液，放入孵箱内于37℃孵育24h后取出，觀察细菌生长情况并将结果记录于表中。细菌不生长的最小浓度为青霉素对金黄色葡萄球菌的MIC。

（3）其余抗菌药物均按上述方法测定对金黄色葡萄球菌209-P的MIC。

4.3.2 纸片法

（1）以灭菌小棉签蘸取金黄色葡萄球菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液，然后轻轻地从4个不同方向平行交叉划线，使菌液均匀涂布于整个琼脂平板表面。

（2）取2000U/mL的青霉素、2000μg/mL的链霉素、四环素、氯霉素、红霉素、2.5%的碘酊各2 mL分装于试管中。用无菌小镊子取圆形滤纸12张，每两张浸于同一种药液中，浸透后取出，沥去过多的药液。将2片含一种药液的滤纸分别放在已接种细菌的琼脂平板表面的不同区域。为了位置间隔准确，最好事先在皿底用标记笔做上记号。

（3）将培养皿放入孵箱内于37℃孵育24 h，观察纸片周围有无抑菌圈，将结果记录于表中。测量抑菌圈的直径，比较各药的抗菌效力。

4.4 抗菌药物的体内抗菌实验

4.4.1 接种法及细菌存活测试

（1）金黄色葡萄球菌各菌株划线至TSB + agar平板上培养>16h；

（2）从板上挑取多个克隆到含有PBS的EP管中，离心收集菌，用PBS洗涤两遍后调菌液浓度至吸光度OD600=0.6，稀释100倍后取100？滋L菌液和lmL全血混合37℃摇床培养。

（3）分别在0h，1h，3h，5h，7h，9h时间点取100？滋L混合培养液，用无菌水稀释10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培养20 h后，计数生长出来的细菌克隆数，以0 h的克隆数作为对照，计算存活率，作图。

4.4.2 抗生素體内治疗干预实验

（1）依据步骤4.3.1体外抗菌实验的得到的各抗生素的最小抑菌浓度值，配制各种常用抗生素合适浓度的母液。

（2）金黄色葡萄球菌各菌株划线至TSB+agar平板上培养>16h；

（3）从板上挑取多个克隆到含有PBS的EP管中，离心收集菌，用PBS洗涤两遍后调菌液浓度至吸光度OD600=0.6，稀释100倍后取100？滋L菌液和l mL全血混合，再加入工作浓度的各种抗生素，37℃摇床培养。

（4）分别在0h，1h，3h，5h，7h，9h时间点取100？滋L混合培养液，用无菌水稀释10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培养20 h后，计数生长出来的细菌克隆数，以0 h的克隆数作为对照，计算存活率，作图。

5 注意事项

（1）充分灭菌的枪头和EP管应当烘干后使用，避免枪头和EP管中残余的水株对稀释结果产生影响。

（2）菌液稀释时，确保正确使用移液器，确保吸取的菌液体积正确。

（3）用移液枪吸取较为粘稠的血液时，动作应当轻柔缓慢，以免血液进入枪管，影响移液枪使用。

（4）使用灭菌小棉签蘸取金黄色葡萄球菌液涂布琼脂平板表面时，棉签蘸取菌液后应当在EP管壁上碾压一下，避免涂布后在平板上留下过多菌液，长成较厚菌苔进而影响后期抑菌圈观察。

（5）菌液涂布时，应当在平板上均匀涂布，避免留下空白区域，影响抑菌圈大小测定。

（6）在进行纸片法测定抑菌效果时，含有抗生素的滤纸片应当贴在事先划好区域的中央，避免抑菌圈交叉对后续观察实验的影响。

（7）滤纸片应当轻轻贴附在平板表面，可用无菌的镊子轻轻按压，切勿造成固体琼脂的破裂和变形，以免影响抑菌圈的大小和形状。

（8）涂布器在涂布前应当使用酒精灯外焰充分灼烧，在无菌区内晾凉后进行涂布实验，避免涂布器温度过高烫死细菌，影响实验数据。

【参考文献】

[1]赵海泉.基础生物学实验指导.微生物学分册[M].中国农业大学出版社，2008.

[2]Zhao L， Xue T， Shang F， Sun H， Sun B. Staphylococcus aureus AI-2 quorum sensing associates with the KdpDE two-component system to regulate capsular polysaccharide synthesis and virulence.[J]. Infection & Immunity， 2010， 78（8）：3506-3515.

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[4]杨革.微生物学实验教程[M].科学出版社，2015.