联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面的愈合作用

朱卫丽　薛小萍

【摘 要】本文旨在研究联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面的愈合作用。首先，选择健康雄性小鼠作为研究对象，制作糖尿病难治创面模型。随后，分别将冻干冷沉淀、冻干血小板、冻干血小板和冻干冷沉淀联合作用于创面，作用5、10、15和20天后观察难治创面的再上皮化速率；作用第15天后收集創面组织并检测血管内皮生长因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表达量。结果表明，FDP组，FDC组和FDP-FDC联合组的再上皮化速率以及血管内皮生长因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表达量均显著高于糖尿病模型组，且FDP与FDC联合组对糖尿病难治创面的愈合效果显著高于FDP组或FDC组。因此，联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面具有较好的促愈合作用。

【关键词】冻干血小板；冻干冷沉淀；糖尿病；创面愈合

中图分类号： R318.08 文献标识码： A 文章编号：2095-2457（2018）06-0090-003

【Abstract】The object of this study is to reveal the effect of combined use of freeze-dried platelets （FDP） and freeze-dried cryoprecipitate （FDC） on promotion the healing of diabetic wound. The model of refractory diabetic wound was first established by using the healthy male mice. The wound was then treated with FDP and/or FDC for 5， 10， 15 and 20 days， respectively. The re-epithelialization rate of the treated wound was observed. Besides， the productions of vascular endothelial growth factor， endothelial nitric oxide synthase and nitric oxide in the treated wound were also determined. Results showed the re-epithelialization rate and the productions of vascular endothelial growth factor， endothelial nitric oxide synthase and nitric oxide of the wound treated by FDP and/or FDC were much better than those of the control model. Moreover， the combined use of FDP and FDC was better than the single use of FDP or FDC. Therefore， the combined use of FDP and FDC was benefit for the healing of diabetic wound.

【Key words】Freeze-dried platelets； Freeze-dried cryoprecipitate； Diabetic； Refractory wound

糖尿病患者的创面常呈现病程长、创面深、反复感染、创面上皮化迟缓等特征，形成创伤后很难治愈，常常导致病人截肢或死亡[1]。寻找能促进糖尿病难治创面愈合的制剂已成为临床急待解决的问题。血小板能释放多种生长因子并诱导细胞发生迁移，促进细胞增殖、分化，从而促进创面收缩，血管生成和组织重塑。而冷沉淀中含有VIII因子、纤维蛋白原、XIII因子以及纤维粘连蛋白等，具有促进组织修复、愈合、肉芽组织再生、止血、抑菌等多种生物学功能[2-3]。因此，血小板和冷沉淀对创面均具有促愈合作用。

然而，由于新鲜血小板和冷沉淀都不易保存，不方便携带。若将二者冻为干粉，制成冻干血小板（Freeze-Dried Platelets，FDP）和冻干冷沉淀（Freeze-Dried Cryoprecipitate，FDC），不仅体积小、重量轻，而且可以长期储存、便于运输，易于量化[4]。本文首次将FDP和FDC联合用于糖尿病难治创面的愈合，将为新型促糖尿病难治创面愈合制剂的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物选用健康雄性ICR小鼠，共40只，由扬州大学比较医学中心提供，链脲佐菌素购于 sigma公司，新鲜血小板和冷沉淀由扬州市红十字中心血站提供，酶联免疫吸附试剂盒购买于广州润坤生物科技有限公司。

1.2 建立STZ 糖尿病小鼠模型

选用健康雄性ICR小鼠，在实验环境中预饲养1周。建模前禁食12h，按65mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液，用以诱发糖尿病。于72 h后测定血糖、尿糖，同时每周测体重。若注射后血糖浓度>16.7mmol/L，尿糖高于2+，即判定为糖尿病动物模型建模成功。

1.3 FDP和FDC的制备

FDP的制备：血小板中加入冻干保护剂（150mmol/L海藻糖、1μmol/LPGE、5mmol/LL-Arg、0.5mmol/L Phy、0.5μmol/L Biva、3% DMSO和5%人血清白蛋白），将处理后的血小板转移到冻干瓶中，每瓶4mL（厚度不超过1.5cm）置于-80℃超低温冰箱中预冻过夜，次日，先将冻干机温度降至-45℃，再将样品迅速移入冻干机进行真空干燥，即得FDP。

FDC的制备：新鲜冰冻血浆在4 ℃下离心，弃去上清液，所得的不溶解絮状物即为冷沉淀，将其冷冻干燥，即得FDC。

1.4 检验联合使用 FDP和FDC对难治创面愈合作用

将实验动物分为四组（每组10只小鼠）：（1）糖尿病模型组：在糖尿病小鼠创面喷洒无菌生理盐水作为对照，无菌纱布包扎，每天一次；（2）FDP治疗组：以FDP：无菌水=3：1（v/v）将FDP复水，调节细胞数，在凝血酶作用下活化，涂于糖尿病小鼠创面，无菌纱布包扎，每天用药一次；（3）FDC治疗组：将FDC中加入无菌生理盐水复溶，涂于糖尿病小鼠创面，无菌纱布包扎，每天用药一次；（4）FDP-FDC联合治疗组：将冻干血小板与冷沉淀复溶后混合涂于小鼠创面，无菌纱布包扎，每天一次。

1.5 创面愈合效果及分子表达的评价方法

创面愈合速度比较：分别于第 1、5、10、15、20 d用透明膜描记法和数码相机记录各组创面大小和变化，在分度为0.1mg的分析天平称取透明膜质量并换算成面积，计算再上皮化率。再上皮化率=（原始创面面积未愈创面的面积）/原始创面面积×100%。

干预后15d时，每组小鼠随机挑选6只处死，剪取创面组织进行匀浆，将匀浆得到的悬液在4℃离心机中以12000r/min的速度离心20min，取上清液，采用酶联免疫吸附试剂盒测定血管内皮生长因子（VEGF）、一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）以及总蛋白含量，并计算每毫克总蛋白中VEGF、eNOS与NO的含量。

1.6 统计分析

采用 SPSS软件录入并分析实验数据，数据均以x±s表示，p < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面再上皮化速率比较

如表1所示，干预后第5，10，15，20 d时，FDP组、FDC组和FDP-FDC联合组的再上皮化速率均显著高于糖尿病模型组，且FDP-FDC联合组的再上皮化速率显著高于FDP组和FDC组，各组两两比较，差异有统计学意义（p<0.05）。

2.2 创面中血管新生分子VEGF、eNOS、NO的表达量

表2所示，干预第15d后，FDP组、FDC组和FDP-FDC联合组小鼠难治创面中的VEGF、eNOS、NO的含量显著高于糖尿病模型组，FDP-FDC联合组的VEGF、eNOS、NO的含量顯著高于FDP组和FDC组，各组两两比较，差异有统计学意义（p < 0.05）。

3 讨论

糖尿病是一种常见的慢性病。随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势， 糖尿病的危害不仅在于以糖代谢为主的一系列代谢紊乱，还包括长期高血糖所引起的并发症，其中，糖尿病性溃疡是糖尿病并发症当中最严重且最难治愈的一种，给个人、家庭乃至国家带来了严重的经济和社会负担。

血小板能释放出20多种生长因子，在伤口愈合过程中，这些生长因子可增加血管的通透性、促进血管生成、软组织上皮化、伤口收缩和组织重塑等[5]。目前，局部应用血小板浓缩物已被越来越多地用于口腔颌面部手术、整形外科、运动医学、泌尿外科等临床医学中[6-7]。由于新鲜浓缩血小板多采用22℃振荡保存，有效期仅为5d，FDP将浓缩血小板经过预处理液处理后冷冻真空干燥，以固态形式在室温下长期储存的一种血小板保存方式，具有体积小、质量轻、不需要特殊保存设备、使用方便等优点。Wolkers[8]等通过电镜及红外光谱分析证明复水化后的FDP的超微结构及膜蛋白成分与新鲜血小板极其相似，在难治创面的治疗方面具有显著优势。FDC是将新鲜冰冻血浆在4℃离心后形成的不溶解的絮状物，经冷冻干燥制备而成的冻干制品，冷沉淀中主要含有VIII因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子、XIII因子、以及纤维粘连蛋白等，可在细胞表面形成坚固的网状结构，具有止血、促进组织修复、愈合和创面肉芽组织的再生，维持渗透压，使炎症反应局限等多种生物学功能。目前，冷沉淀已被局部外用于烧伤创面、肛肠手术、包皮环切术等术后的愈合[9-10]。为了明确两者联合使用对糖尿病难治创面愈合的影响，本文对干预后的创面再上皮化速率进行了动态分析，发现干预后第5、10、15、20 d时，FDP组、FDC组和FDP-FDC联合组的再上皮化速率均显著高于糖尿病模型组，FDP-FDC联合组的再上皮化速率显著高于FDP组和FDC组，说明冻干血小板和冻干冷沉淀均有促进糖尿病难治创面愈合的效果，而且联合使用冻干血小板和冷沉淀对糖尿病难治创面的愈合作用更优于单独使用。

NO是反映血管内皮功能的重要标志物之一，NO生理水平增加引起血管扩张，增加循环血量和氧供应，可发挥保护血管内皮细胞的作用。通常，在内皮细胞中，NO主要是由eNOS介导催化生成，因此，作为血管内皮保护因子通过调节NO生物合成发挥作用[11-12]。VEGF 是血小板释放的多种生长因子的一种，是体内促血管生成作用最强的有丝分裂原，对内皮细胞的分化、增殖以及迁移具有促进作用。我们对糖尿病难治创面的上述三种血管新生分子的分析发现，干预后第15 d，FDP组、FDC组和FDP-FDC联合组小鼠溃疡创面中的VEGF、NO的含量显著高于糖尿病模型组，FDP-FDC联合组的VEGF、NO的含量显著高于FDP组和FDC组，说明冻干冷沉淀和冻干血小板对血管的新生具有促进作用，而且联合使用冻干血小板和冷沉淀的作用更优于单独使用。

综上所述，联合使用冻干血小板和冷沉淀具有促进糖尿病难治创面愈合的作用，且其作用大于单独使用冻干血小板或冻干冷沉淀。由于冻干血小板及冻干冷沉淀均为生理性凝血物质，组织相容性好，易降解、吸收，无毒副作用；且体积小，运输方便，可室温长期保存，在保存期内可保持内部成分稳定。因此，若将冻干血小板和冻干冷沉淀联用作为促糖尿病难治创面愈合制剂，必然会具有广阔的临床应用前景。

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