福建省53份茶树种质资源SSR—PCR反应体系的优化

朱晨　田采云　张舒婷

摘要[目的]优化茶树种质资源SSR-PCR反应体系。[方法]以福建省不同地区的53份茶树种质资源作为SSR-PCR体系优化的供试材料，通过L16（43）正交试验设计，对茶树SSR-PCR反应体系的3个影响因素：DNA模板浓度（ng/μL）、引物浓度（mmol/L）和Taq酶浓度（U）在4个水平上进行比较筛选，并进行PCR验证。[结果]优化后最佳的福建省茶树SSR-PCR反应体系为25 μL体系，其中 DNA模板浓度50 ng/μL、引物浓度0.25 mmol/L、Taq酶浓度1.25 U。并从23对茶树SSR引物中筛选出5对清晰、明亮、無杂带的引物，适用于福建省茶树SSR标记的进一步研究。[结论]该研究可为后续福建省茶树品种的亲缘关系分析、杂交品种的选育等研究提供依据。

关键词茶树；种植资源；SSR-PCR；体系优化；正交设计

中图分类号S571.1文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0088-04

Optimization of SSRPCR Reaction System for 53 Tea （Camellia sinensis） Germplasm Resources in Fujian Province

ZHU Chen1，2， TIAN Caiyun1， ZHANG Shuting1，3 et al

（1.College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，Fujian 350002；2.Key Laboratory of Tea Science in Fujian Province， Fuzhou，Fujian 350002；3.Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，Fujian 350002）

Abstract[Objective]To optimize the SSRPCR reaction system for tea germplasm resources.[Method]Fiftythree tea plant germplasm resources in different regions of Fujian Province were used as the optimized materials for the SSRPCR system. Through the L16（43） orthogonal design， three factors affecting the SSRPCR reaction system of tea plant， DNA template concentration （ng/μL）， primer concentration （mmol/L） and Taq enzyme concentration （U） were screened at four levels， and PCR verification was performed. [Result]The optimum SSRPCR reaction system for tea in Fujian Province was 25 μL system， in which the concentration of DNA template was 50 ng/mL， primer concentration was 0.25 mmol/L， Taq enzyme concentration was 1.25 U. From 23 pairs of SSR primers， 5 pairs of primers with clear， bright and nostray bands were selected， which is suitable for further study on SSR markers of tea plants in Fujian Province. [Conclusion]This study provides a basis for the analysis of the genetic relationship and hybrid breeding of tea cultivars in Fujian Province.

Key wordsCamellia sinensis；Germplasm resource；SSRPCR；System optimization；Orthogonal design

茶树（Camellia sinensis）属于山茶科山茶属，是多年生、木本、常绿植物，福建省是茶叶的主产地之一，该省茶树栽培历史悠久，种质资源丰富[1]。近年来随着新品种选育研究和示范推广工作的不断深入，越来越多的优良茶树新品种对茶区产量和品质提升起到了推动作用[2]。但优质茶树种质资源应用并不容易，因此，应进一步发掘、鉴定、筛选和推广具有众多优良遗传性状的种质资源[3]。传统的育种方法选育周期长，亲本选择范围有限，种质资源的识别、鉴定困难等问题，限制了茶树种质资源研究工作的进一步深入。

SSR（simple sequence repeat）标记是以串联重复DNA序列PCR扩增为核心的新型DNA分子技术[4]。SSR分子标记技术具有基因组覆盖率、多态性高，多等位基因特性显著，遗传信息量大等优点，在分子标记领域得到广泛认可[5]，并已运用到众多作物领域[6-8]。

已有报道显示，由于不同茶树品种的SSRs重复基元和重复次数都存在变异，同时SSRs两侧序列保守性高[9]，可以在SSRs的侧翼序列上设计特异引物[10]，进行PCR扩增，电泳检测，依据扩增产物的多态性位点对茶树种质资源进行识别、鉴定、研究和分析[11]。SSR技术作为一种理想可靠的分子标记技术可以运用于茶树遗传连锁图谱构建[12]、茶树亲缘关系[13]、茶树遗传多样性[14]、茶树种质资源鉴定和新品种选育等研究中[15]。

福建省茶树SSR技术研究起步较晚，适用于福建省茶树SSR标记数据库信息有限，国内外有关福建省茶树SSR-PCR体系优化的报道较少，这在极大程度上制约了福建茶树遗传分析、种质资源鉴定等研究的深入[16]。因此，建立适合福建省茶树的SSR-PCR扩增体系至关重要。笔者以课题组的转录组数据为依托，开发适用于福建省茶树SSR的相关引物，并利用L16（43）正交试验对福建省茶树SSR-PCR反应体系进行优化筛选，旨在建立稳定高效的福建省茶树SSR-PCR反应体系，为后续SSR分子标记技术应用于福建省茶树亲缘关系分析和遗传多样性分析，揭示当前福建省茶树种质资源的现状提供技术支持。

1材料与方法

1.1材料

53份供试材料采自福建省7个地区（表1），采后将茶树叶片置于密封袋中，经液氮处理后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1茶叶DNA提取。

茶树基因组DNA提取参照王磊等[17]的改良CTAB法，用2%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。

1.2.2SSR引物筛选。

根据茶树转录组数据运用Primer 3程序，选取23对SSR引物进行筛选，SSR-PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，退火（温度根据不同引物而定）1 min，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。选择扩增条带单一、清晰明亮、无严重拖带的引物进行后续SSR-PCR反应体系的优化研究。

1.2.3

SSR-PCR反应体系筛选。

采用L16（43）正交试验设计，对茶树SSR-PCR反应体系的3个影响因素：DNA模板浓度（ng/μL）、引物浓度（mmol/L）和Taq酶浓度（U）在4个水平上进行比较筛选，L16（43）正交试验设计见表2。

1.2.4最适退火温度筛选。

利用筛选出的SSR引物，根据各引物Tm值，选取48～56 ℃之间9个梯度的退火温度进行试验，根据退火温度下的SSR-PCR扩增结果进行比较，确定各引物的最适退火温度。

1.2.5SSR-PCR优化体系验证。

从筛选出的SSR引物中随机选取一个引物，同时从53个茶树DNA模板中随机选取12个，根据2%琼脂糖电泳检测和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）[18]的扩增结果综合判断福建省茶树SSR-PCR优化体系是否可靠。

2结果与分析

2.1SSR引物筛选结果

根据电泳结果显示，23对引物中筛选出5对扩增結果符合预期的引物（G2、G6、G16、G19、G22），扩增条带单一、清晰明亮、无严重拖带、扩增效果最佳（图1）。另外18对SSR引物存在扩增条带多且不够清晰明亮的问题。

2.2SSR-PCR体系优化结果

根据茶树SSR-PCR反应L16（43）正交试验设计，PCR扩增后的电泳结果如图2所示，16个组合中有10个组合的扩增条带明亮，3号、4号、5号、6号、9号、11号和12号组合存在非特异性扩增条带；1号、2号和7号主带明显，无非特异性扩增条带，其中7号组合扩增出的条带最为清晰明亮、单一、稳定性最好且无其他杂带，因此7号组合为最佳的SSR-PCR反应体系，该体系的组合为DNA模板50 ng/μL、引物0.25 mmol/L、Taq酶1.25 U。

2.3最适退火温度的确定

退火温度影响SSR引物与DNA模板的特异性结合，利用之前筛选出来的G2、G6、G16、G19和G22这5对最佳的SSR引物进行退火温度PCR扩增，PCR电泳结果（表3）表明退火温度过高或过低时，PCR扩增条带都不太理想；当退火温度为50～51 ℃时，各引物扩增的谱带清晰丰富，因此确定后续SSP-PCR扩增体系验证时的各引物的最佳退火温度。

2.4SSR-PCR扩增体系验证分析

在筛选出的G2、G6、G16、G19、G122这5对SSR引物中随机选取G6引物，并从53份茶树种质资源中随机选取12份DNA模板进行SSR-PCR扩增体系验证，根据2%琼脂糖凝胶电泳结果可知扩增条带清晰明亮、单一、平整无杂带（图3）；同时10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）扩增电泳结果显示SSR-PCR扩增体系扩增出的条带清晰、多态性较强（图4），以上结果表明该SSR-PCR优化体系具有较好的稳定性和可重复性，适用于福建省茶树种质资源的SSR分析研究。

3结论与讨论

SSR分子标记检测过程中最重要的环节就是PCR扩增，建立稳定的SSR-PCR反应体系和扩增程序是SSR分析的必要前提。而SSR-PCR反应体系涉及诸多因素，各因素均可能对PCR扩增的敏感性、特异性和扩增产量产生影响[19]，如用未优化的SSR-PCR体系进行试验，会导致PCR扩增结果的准确性大大降低，不利于SSR分子标记发挥其应有的作用，从而进一步影响到后续的遗传关系鉴定、亲缘分析、杂交亲本的选育、遗传图谱构建工作的开展[20]。一般进行SSR-PCR反应体系优化的方法有2种，分别为正交试验法和单因素试验法。单因素试验法过程繁琐，需要根据各个因素的改变进行反复多次试验，耗费成本高，且各因素间的互作效应易被忽略[21]。相比单因素试验法，正交试验设计就完全避免了以上缺陷。正交试验设计既能做到分散性效果均衡检测，又能综合分析比较各个因素的互作影响，还可以对单个因素水平不同时的扩增结果进行检测分析。该研究采用正交试验设计法，通过DNA模板和引物的随机抽取，尽量降低偶然性误差对试验结果的影响[22]，并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）SSR-PCR扩增体系优化的验证，从多方面确保SSR-PCR优化体系结果的准确可靠[8]。

在SSR-PCR体系优化试验中，当DNA模板、引物和Taq酶浓度过高或过低时，会导致PCR扩增的重复性下降、碱基错配、形成引物二聚体和非特异性产物产生[23]。同时，退火温度直接影响PCR的扩增效率和扩增产物的大小，过低的退火温度易产生多条杂带，不利于后续条带统计分析，过高则PCR扩增准确度下降，目的条带模糊。因此须对不同引物进行退火温度筛选，以确定各引物的最适退火温度[24]。

经过SSR-PCR优化体系和验证试验，确认福建省茶树种质资源最佳SSR-PCR反应体系为Taq酶1.25 U（12.5 μL）、ddH2O 9.5 μL、DNA模板1 μL（浓度50 ng/μL）、上下游引物各1 μL（浓度0.25 mmol/L），总体积25 μL。在这个反应体系下进行SSR-PCR反应体系优化验证，得到的条带清晰明亮、平整、无杂带和拖带。表明该SSR-PCR优化体系稳定、可靠、重复性良好，可以进一步用于福建省茶树种质资源亲缘关系分析、优良品种选育等研究，为现有福建省珍稀茶树种质资源的鉴别和保护，建立省级优良茶树种质资源的SSR指纹图谱，以及福建省茶树核心种质资源库的建立提供科学依据。

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