兰科植物FNR基因的密码子偏好性分析

李蓉 谢析颖 王雪晶 苏立遥 林玉玲 郭容芳 陈裕坤 赖钟雄 徐涵

摘 要 为揭示兰科植物FNR基因的特性和密码子偏好性，采用DNAMAN、CodonW和SPSS软件及 EMBOSS、SWISS-MODEL在线网站对17种兰科植物的FNR基因序列、氨基酸序列、同源区域及蛋白质三维结构进行分析。结果表明：兰科植物FNR基因普遍具有在A/T（U）与G/C之间较弱的密码子偏好性；密码子的末位在A和T（U）之间存在显著的T（U）偏好性，在C和G之间存在显著的C偏好性；NADP结合域比非结合域有较小的密码子偏好性；基于CDS和氨基酸聚类结果比基于RSCU聚类更接近于植物的进化分类；自然选择的作用是导致兰科植物FNR基因的密码子使用偏好性的主要成因。

关键词 兰科；FNR基因；密码子偏好性

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Codon Usage Bias of Ferredoxin-NADP+ Oxidoreductase （FNR）

in Orchidaceae

LI Rong1， XIE Xiying1， WANG Xuejing1， SU Liyao1， LIN Yuling1， GUO Rongfang1，

CHEN Yukun1， LAI Zhongxiong1*， XUHAN Xu1，2*

1 Institute of Horticulture of Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， Toulouse 313008， France

Abstract For a good understanding of the codon usage bias of ferredoxin-NADP+ oxidoreductase （FNR） in Orchidaceae， the gene sequence， amino acid sequence， homologous region and three-dimensional protein structure of 17 FNR genes in Orchidaceae were analyzed by DNAMAN， CodonW， SPSS softwares， and EMBOSS， SWISS-MODEL online programs. The results showed that there was a low-level codon usage bias in FNR genes between A/T（U） and G/C； there existed a significant T（U） bias between A and T（U） and a significant C bias between C and G in the codons； NADP binding domain showed less codon bias than that of the non-binding domain； the cluster tree based on coding sequence （CDS） as well as amino acid sequences matched better with the plant evolution classification； the codon usage bias of FNR was mainly influenced by the natural selection in Orchidaceae.

Key words orchidaceae； FNR gene； codon usage bias

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.015

基因表達是细胞在生命活动过程中将储存在DNA双链中的遗传信息转录、翻译为具有生物活性的蛋白质的过程。其中，翻译阶段通过三联体密码子进行遗传信息的传递。密码子编码的氨基酸中，除甲硫氨酸和色氨酸之外，其它氨基酸均由2种或2种以上的密码子编码，这种编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon），其在不同物种、不同基因中的出现具有一定的偏好性，即密码子选用偏好性（codon usage bias，CUB）。密码子选用偏好性的评价参数主要有有效密码子数（Effective number of codons，ENC）、同义密码子相对使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、不同位置的G+C含量、密码子适应指数（Codon adaptation index，CAI）等[1]。ENC能够表示指定密码子偏离同义密码子的平均使用频率的高低，能同时反映基因的表达水平及对密码子的偏好性[2]。RSCU描述了指定密码子在同义密码子中的相对概率，直观地表示了基因对某一密码子的使用偏好性。不同位置的G+C含量可用于分析密码子偏好性的原因。CAI是反映编码区同义密码子与密码子最佳使用相符合程度的指数。

铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶（Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase，FNR）在藻类、光合细菌及高等植物中均广泛存在[3]。FNR是以非共价键结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基的单体

酶[4-5]。第一个FNR基因是从豌豆类囊体中分离到的，FNR有多种同源蛋白[6-9]。研究发现FNR主要负责Fd（ferredoxin）与NADP+之间的电子传递，用于卡尔文循环中CO2的固定和叶绿体的其他代谢过程。近年来，已有研究表明植物中FNR基因不仅参与光合作用中电子传递的过程，而且作用于生长发育密切相关的环式电子传递过程及抵御氧化胁迫[10]，因此挖掘该基因的功能具有重要意义。在基因的功能研究中遗传转化是一种重要的手段[11-12]。已有研究表明，被导入基因功能的体现与植物类群、物种甚至组织特异性的密码子偏好性相关[13-15]。在植物生长发育中发挥重要作用的FNR基因的密码子使用情况尚未见报道。本研究在已完成的文心兰FNR基因表达及表型鉴定的基础上，结合兰科植物FNR的基因序列、氨基酸序列、蛋白质三维结构进行密码子偏性及形成原因分析，旨在为兰科植物FNR基因的功能挖掘提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以文心兰的FNR基因序列（GenBank登录号为KX461908）为探针，在NCBI的数据库及2个兰科植物生物信息数据库Orchidbase和Orchidstra中，通过blastn查找同源的FNR基因，去除冗余序列后，选择兰科11个属具有完整ORF的17条FNR基因序列用于本研究（表1）。

1.2 方法

将获得的序列整理后，在CodonW软件运行获得ENC、CAI及RSCU值，运用EMBOSS网站（http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）运算获得ENC、不同位置G+C含量，在EXCEL中进行整理，运用SPSS19.0、MEGA5.1及ORIGIN8.5软件进行数据分析和绘图分析。由于本研究17条FNR基因分别属于兰科11个属，其中蝴蝶兰属植物（Phalaenopsis spp.）占7个。因此，对蝴蝶兰属FNR基因的同义密码子相对使用度（RSCU）及具有偏好性氨基酸在不同区域比例进行单独分析。

1.2.1 同义密码子相对使用度（RSCU）分析 同义密码子相对使用度表示指定密码子偏离同义密码子的程度，当RSCU>1时，表明该密码子使用频率高于其他同义密码子；当RSCU<1时，表明该密码子使用频率低于其他同义密码子；当RSCU=1时，表明该密码子无偏好性。

1.2.2 主要偏好密码子分析 ENC值能够同时反映基因的表达水平及其对密码子使用的偏好性，取值范围在20～61内，该值越小，表明该基因表达水平越高，对指定密码子的选择偏好性较强；反之，表达量越低且选择偏好性弱[16]。根据所研究基因的ENC值进行排序，选择前后10%作为高低表达样本，计算其平均RSCU值，然后计算高低表达样本的ΔRSCU值，选择高表达样本中平均RSCU>1且ΔRSCU>0.2，低表达样本中平均RSCU<1且ΔRSCU>0.2的作为主要偏好密码子[17]。

1.2.3 不同区域FNR基因密码子偏好性分析 运用NCBI网站的Conserved Domain Search 分析预测FNR基因的结合域，分析其蛋白质三维结构及与同源区域的关系，并统计该结合域及结合域外具有密码子使用偏好性的氨基酸所占的比例。

1.2.4 系统聚类分析 以本研究中17条兰科植物FNR基因的RSCU值作为变量，基于欧式平方距离采用SPSS19.0离差平方和法（ward法）进行密码子使用偏好性聚类分析[18]；同时采用MEGA5.1的组间邻接法（Neighbour-Joining，NJ）构建FNR基因CDS序列、氨基酸序列系统进化树，并比较3种聚类结果。

1.2.5 中性绘图分析 根据已获得密码子不同位置的G+C含量，计算GC1（密码子第一位的G+C含量）与GC2（密码子第2位的G+C含量）的平均值，记为GC12。以GC3（密码子第三位的G+C含量）为横坐标，GC12为纵坐标作图，通过分析密码子第3位与第1～2位碱基组成的关系，分析密码子偏好性的影响因素。

1.2.6 ENC绘图分析 以本研究中17条FNR基因的GC3为横坐标，ENC为纵坐标绘制散点图，如果指定密码子的使用频率只是由于碱基突变引起，则：

ENC=2+GC3+29/（2伊GC32-2伊GC3+1）[17， 19]

以此公式绘制ENC的期望曲线，分析影响密码子偏好性的因素。

1.2.7 PR2分析 PR2分析（ PR2-bias plot analysis）是为了研究密码子第3位碱基A与T和 C与G之间是否有突变不平衡现象。根据偏倚规则（ parity rule 2，PR2），如果2条互补链间不存在任何突变或选擇效应上的偏倚，那么碱基含量上应该有A=T和C=G。因此，以本研究中17条基因的A3/（A3+T3）为纵坐标，G3/（G3+C3）为横坐标，绘制散点图进行分析。

2 结果与分析

2.1 兰科植物FNR基因有效密码子数和GC含量

通过EMBOSS在线网站分析编码区序列不同位置的G+C含量、ENC值和CAI值（表2）。结果显示，GC1、GC2变化幅度较小，GC3变化范围较大，分布在42%～64%；在17条FNR基因序列的GC1、GC2、GC3和GCall均值中，GC3值为53%，略大于50%，GCall小于50%，表明密码子第一和第二碱基偏好A/T（U），第三碱基偏好使用G/C；ENC值均大于46，表明兰科植物FNR基因的表达水平较低，且在编码氨基酸时对密码子的选择偏好性较弱；CAI指数均在0.1～0.3之间，远小于1。此结果进一步表明兰科植物FNR基因对密码子的选择偏好性较弱。

2.2 兰科植物FNR基因同义密码子相对使用度

利用CodonW软件计算17条FNR基因序列的RSCU值（表3）。结果显示，RSCU>1的密码子有28个（占全部密码子的43.75%），其中以T（U）结尾的有10个，以A结尾的有3个，C结尾的有8个，G结尾的有7个。Met和Trp各只有一个密码子编码，Gln有2个使用度相同的同义密码子，其他编码FNR基因的氨基酸及终止密码子均呈现偏好性，可见密码子偏好性涉及几乎所有的具有同义密码子的氨基酸，呈现普遍的密码子选用偏好性，其中以G/C结尾的密码子占53.6%。

单独计算蝴蝶兰属7个FNR基因的密码子发现，其中有26个具有偏好性的密码子，分别以7个C结尾、8个G结尾、9个U结尾、2个A结尾。因此，蝴蝶兰属末位密码子没有在CG之间的偏好，但末位密码子在A和T（U）之间存在显著的T（U）偏好性。

去除蝴蝶兰属计算兰科其他属共10个FNR基因的密码子，共有29个具有偏好性的密码子，分别有10个C结尾、5个G结尾、10个U结尾、4个A结尾。因此，兰科植物除了蝴蝶兰属之外的其他属植物，末位密码子在C和G之间存在显著的C偏好性，且末位密码子在A和T（U）之间同样具有显著的T（U）偏好性。

2.3 主要偏好密码子分析

根据17个FNR基因的ENC值计算得到的ΔRSCU值进行评价排序，共鉴定出1个主要偏好密码子AAU，其RSCU=0.465>0.4，编码氨基酸是天冬酰胺（Asn）。针对蝴蝶兰属的样本进行分析鉴定出1个编码亮氨酸（Leu）的CUU密码子；当去除蝴蝶兰属植物进行分析可得到编码5种氨基酸的6个主要偏好密码子（表4）。

2.4 不同区域FNR基因密码子偏好性分析

NCBI在线预测结果表明，本研究中17条已知兰科植物FNR基因均有NADP结合域，且该区域与DNAMAN中比对的同源区域高度重合（图1），并且位于该基因蛋白质三维结构中保守性极高的亚基2（图2）。此外，分析其保守结构域、非保守结构域及CDS序列，呈现密码子使用偏好性氨基酸所占的比例（图3），这表明具有密码子选用偏好性的氨基酸在各个区域均表现出较高的比例，说明兰科植物FNR基因都表现出较普遍的密码子选用偏好性，其中NAD/NADP结合域比非结合域有较小的密码子偏好性。

2.5 基于密码子使用偏好性和CDS序列的系统聚类

对本研究中的17条FNR基因序列（图4）、氨基酸序列（图5）和同义密码子偏好性相对使用度（图6）进行了聚类分析。结果显示，核酸序列与氨基酸序列聚类之间大致相同，而同义密码子相对使用度的聚类结果与前两者差异较大，主要分为两大类，第一类是蝴蝶兰属，第二类是其他兰花，且第二类又分出3个分支。

2.6 中性绘图分析

同义密码子通常只有第3位碱基不同，因而可减少有害突变；反之，发生在密码子前2位碱基的突变是非同义且有害的。中性绘图分析通过研究GC3与GC12（GC1与GC2的平均值记为GC12）之间的关系，从而确定碱基突变与自然选择对密码子偏好性的影响程度。因此，以GC3与GC12为横纵坐标进行中性绘图，结果显示，所有基因都分布在对角线较远的方位（图7），表明兰科植物FNR基因编码氨基酸时对密码子选择的偏爱性主要受自然选择压力的影响，突变的作用较弱。

2.7 ENC绘图分析

ENC绘图结果显示，17条FNR基因对应的点均分布在ENC期望曲线下较远的方位（图8），表明该基因ENC值偏小。其中，蝴蝶兰属的7条FNR基因的点集中在距离期望曲线最远的地方，表明兰科植物中蝴蝶兰属的FNR基因的ENC值普遍偏小。

该图表示突变压力与自然选择对FNR基因密码子偏好性的作用程度。三角框内的点包括了蝴蝶兰属及其他两属的数据。

The figure shows the effect of mutation pressure and natural selection on the codon usage bias of FNR in Orchidaceae. The boxed corresponds to the data including Phalaenopsis and two other generic data.

ENC和GC3值之间的对应关系表示密码子偏好性与基因表达水平和选择压力的关系。三角框内数据对应蝴蝶兰属。

ENC and GC3 show codon bias in relation to gene expression level and selection pressure. The boxed corresponds to the Phalaenopsis data.

2.8 PR2偏差分析

在PR2分析中，当G3/（G3+C3）或者A3/（A3+T3）的值偏离0.5时，表明该基因密码子偏好性受到除碱基突变之外因素的影响。以本研究中17条FNR基因的PR2偏好分析，结果显示，兰科植物FNR基因对应的数集呈均匀对称分布在横坐标轴0.5位置的两侧（图6），表明密码子在G和C之间没有显著的偏好性。同时，该数集均分布在纵坐标0.4附近的位置，显示密码子在A和T（U）之间具有一定的偏好性。

该图表示兰科植物FNR基因同义密码子中嘌呤和嘧啶之间的选用偏好性。三角框内数据对应蝴蝶兰属。

The pattern shows codon bias between purings and pyrimidines in FNR genes in Orchidaceae. The boxed corresponds to the Phalaenopsis data.

3 讨论

3.1 兰科植物FNR基因密码子偏好性分析

在禾本科基因组序列的研究中，竹类植物（竹属）与水稻（稻属）的密码子选用偏好性相近，但与玉米（玉蜀黍属）和麦类（小麦属）存在差异，表明单子叶植物的同一科内各属间存在密码子选用的偏性差异[20]。本研究中兰科17条FNR基因的整体分析表明，兰科植物FNR基因在编码氨基酸时，末位密码子在A和T（U）之间存在显著的T（U）偏好性，G和C之间无较大差异；而去除蝴蝶兰属植物的分析结果表明兰科植物具有显著的C偏好性，说明单子葉植物兰科属间在密码子偏好性上可有各自的特性，也说明兰科植物FNR基因的密码子偏好性不强的原因是出现偏好性嵌合的状态，这一方面表现在密码子第一、二位偏好A/T（U）和结尾位偏好C之间的偏好性镶嵌，另一方面表现在兰科FNR基因与蝴蝶兰属FNR基因之间偏好性差异，推测兰科不同属间FNR基因在进化过程中产生的差异可通过密码子偏性显示出来。NADP结合域是FNR基因发挥功能的关键结构[21]，本研究的分析结果表明，该基因在NADP结合域中偏好性氨基酸比例较低，推测兰科不同属间FNR基因在进化过程中产生的差异首先是通过非核心功能区的密码子偏性开始的。

近年来，密码子偏好性的研究在模式植物、农作物及园艺作物的研究结果表明，G/C结尾的密码子在单子叶植物中使用得更多，A/T（U）结尾的密码子则在双子叶植物中应用更广[22-27]。相关研究中铁皮石斛（兰科）尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因、霍山石斛MYB1R1转录因子及蝴蝶兰、文心兰叶绿体基因组密码子偏好使用A/T（U）结尾的密码子，兰科植物FT基因则偏好G/C结尾的密码子[28-32]。本研究揭示的不同属、不同密码子位点和不同结构域等3个层次的密码子偏好镶嵌性首次展示了兰科植物基因密码子偏好性的多样性，其中不同结构域的保守性在密码子偏好性的差异，也为研究基因的功能和演化提供了不同的视角。

3.2 兰科植物FNR基因聚类分析比较

根据兰科植物FNR基因功能的稳定及氨基酸序列最终保持蛋白质的功能，氨基酸的聚类分析表明17条FNR基因目前的状态，FNR密码子选用偏好性是核酸序列由于碱基突变产生的同义密码子选用的转换，从而表现为区别于氨基酸聚类和CDS序列的聚类结果，其聚类位置的差异表现出所在物种的FNR基因的保守程度，而核酸序列与氨基酸序列的差异表现出所研究兰科各种类的变异程度。

通常认为亲缘关系较近的物种密码子偏好性较为一致，因此密码子偏好性聚类也常常作为物种遗传结构分析的重要参考标准[33]。本研究中的17条兰科植物基于CDS、氨基酸序列的聚类结果与兰科植物基因组复制事件聚类结果相似[34]，而FNR基因基于RSCU聚类结果与基于CDS、氨基酸序列的聚类结果有明显差异，表明基于CDS、氨基酸序列聚类方法更符合植物进化规律，而对于RSCU聚类产生的差异，推测其原因是密码子选用偏好性聚类在较小的分类单元中具有较高准确性，在较大样本分类中，只能作为传统分类的补充[28， 35]。

3.3 兰科植物FNR基因密码子偏好性影响因素

基因长度、GC含量、tRNA丰度、mRNA二级结构、蛋白疏水性、氨基酸保守性、基因表达水平及遗传密码修复等基因组特征均与密码子的偏好性有关[30]。自然选择和碱基突变也是密码子偏好性不可忽略的影响因素。本研究中兰科植物FNR基因的密码子中性绘图、ENC绘图及PR2偏好性综合分析表明，该基因的密码子偏好性是以选择压力的影响为主，与该基因表达水平有较强关系。该分析结果与兰科植物FT基因[17]及文心兰叶绿体基因组[31]密码子偏好性的影响因素一致，而蝴蝶兰叶绿体密码子的偏向性主要受碱基差异和自然选择，两者影响程度相差不大，且碱基组成大于基因表达水平对它的影响，表明兰科植物之间密码子偏好性的影响因素存在差异。

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