烟草疫霉侵染后剑麻H.11648叶片细胞超微结构和防御酶活性研究

张燕梅 李栋梁 李俊峰 赵艳龙 鹿志伟 杨子平 陆军迎 周文钊

摘 要 斑馬纹病是剑麻的主要病害之一，本研究以剑麻斑马纹病高感品种H.11648为材料，分别在接种烟草疫霉0、24、36、48、72 h取样，用电镜观察H.11648叶片细胞超微结构变化，同时分析过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性变化情况。结果表明：H.11648在接种24 h，可见大量休止孢，叶绿体结构被破坏，植物组织开始降解，随着时间延长，附着孢出现，吸器形成，植物组织解体更严重，接种72 h，可见大量菌丝。在整个接种过程中，CAT、PAL和PPO活性显著增强，72 h达到最高，分别为501.44、25.73、1 742.67 U/（g.min）。SOD和APX活性显著下降，72 h达到最低，分别为2 888.62 U/g和841.96 ?mol/（g.min）。POD活性先下降72 h又上升，但均显著低于接种前POD活性。本研究从细胞学和生理水平为探讨剑麻与烟草疫霉互作关系提供了理论基础。

关键词 剑麻；烟草疫霉；超微细胞结构；防御酶

中图分类号 S563.8 文献标识码 A

Changes in Ultrastructure and Activities of Defense-related Enzymes in Leaves of Sisal H.11648 after Phytophthora nicotianae Breda Infection

ZHANG Yanmei， LI Dongliang， LI Junfeng， ZHAO Yanlong， LU Zhiwei， YANG Ziping，

LU Junying， ZHOU Wenzhao*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Zhanjiang Key Laboratory for Tropical Crops genetic improvement， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Zebra disease that caused by Phytophthora nicotianae Breda， is a major disease of sisal. In the present study， ultrastructural changes were examined by transmission and scanning microscopies and the activities of some defense-related enzymes （superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， peroxidase （POX）， ascorbate peroxidase （APX）， phenylalanine ammonia-lyase （PAL） and polyphenol oxidase （PPO）） were investigated in the leaves of susceptible sisal H.11648 at 0， 24， 36， 48， 72 h after they were inoculated with P. nicotianae breda. Many cysts were observed at 24 h after inoculation， and the chloroplast structure was destroyed and the plant tissue began to be degraded. With the prolongation of infection time， the appressorium appeared， haustoria formated，and plant tissue was seriously degraded. Many hypha were observed at 72 h after inoculation. The activity of CAT， PAL， PPO significantly increased during the infection process and reached the maximum value at 72 h after inoculation. The activity of CAT， PAL， PPO was 501.44， 25.73， 1 742.67 U/（g.min）， respectively. The activity of SOD and APX significantly decreased during the infection process and reached the minimum value at 72 h after inoculation. The activity of SOD and APX was 2 888.62 U/g and 841.96 ?mol/（g.min）， respectively. The activity of POD showed a decline at the beginning and then increased at 72 h after inoculation， but was lower than that of POD at 0 h after inoculation. The results would provide a cytological and physiological reference for revealing the interaction between sisal and P. nicotianae Breda.

Key words sisal； Phytophthora nicotianae Breda； ultrastructure； defense-related enzyme

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.018

剑麻不仅是一种极具特色的热带纤维作物，同时也是一种重要的生物质能源作物[1-2]，剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料[3]，剑麻渣可制药[4]。近年来，剑麻作为景天庚代谢的模式植物[5]，有非常重要的理论和经济价值。

斑马纹病是剑麻的主要病害之一，主要由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）引起，因斑马纹病导致大面积剑麻园被毁，纤维产量下降，嚴重影响了剑麻产业的发展[6-7]。国内外学者对该病进行了大量研究，形成了一套完整的病原菌分离、鉴定和防治技术[8-9]，汪平等[10]利用转录组测序技术探讨烟草疫霉处理前后的剑麻H.11648 RNA水平的变化，挖掘剑麻H.11648抗病相关基因，张燕梅[11]和Gao等[12]分别利用转基因技术，将外源基因转入剑麻H.11648中，提高H.11648对烟草疫霉的抗性。但关于烟草疫霉是如何侵染剑麻，侵染后的行为是怎样的，剑麻和烟草疫霉两者是如何互作的还不了解，对烟草疫霉的致病机制和剑麻的抗病机理仍不清楚，也没有关于该病电镜观察和防御酶活性测定方面的报导。针对上述现象，本研究以剑麻烟草疫霉感病品种H.11648为材料，通过对H.11648与烟草疫霉互作前后的防御酶活性和叶片细胞超微结构的变化进行了研究，旨在从细胞学和生理生化水平为探讨烟草疫霉在剑麻上的致病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为2年生剑麻H.11648盆栽苗，菌株为本实验室前期分离保存的烟草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）。

1.2 方法

1.2.1 病原接种 将保存于PDA斜面的烟草疫霉转接到V8培养基上，28 ℃培养1周后接种。病原接种采用菌斑活体接种法，选取同一螺旋健康的叶片，接种前先用无菌水将叶片擦洗干净，再用酒精棉反复擦拭叶片，然后用灭菌大头针刺伤叶片表面，取直径0.5 cm大小的菌饼将带菌丝面贴于伤口处，用棉花保湿，每隔2 h加1次水，每3个生物学重复当作1个处理，每个处理重复3次。

分别在接种0、24、36、48、72 h时取离病斑0.5 cm外的H.11648叶片，经液氮速冻后保存，用于防御酶活性测定。同时取健康组织和病斑交接处的H.11648叶片，经固定液固定后，保存于4 ℃用于电镜观察。

1.2.2 电镜观察 扫描电镜观察：分别在接种0、24、36、48、72 h取H.11648叶片正常与病斑交接处的组织，先用物理法断裂，然后经固定、脱水、置换、干燥、制样、喷金镀膜后在Philips XL-30型扫描电子显微镜下观察剑麻叶片断层细胞及其内含物的变化情况。具体参照李栋梁[13]的方法进行。

透射电镜观察：分别在接种0、24、36、48、72 h取H.11648叶片正常与病斑交接处2～3 mm厚的组织，迅速投入前固定液[2%戊二醛、0.05 mol/L pH 7.2 二甲基砷酸钠（Na-CaCO）]中4 ℃保存。观察前先用缓冲液冲洗3次，再经固定、脱水、置换、浸透与包埋后进行切片（Leica UltracutR），最后染色后置于CM100透射电镜下观察烟草疫霉侵染过程中剑麻细胞的超微结构。具体参照李栋梁[13]的方法进行。

1.2.3 防御酶活性测定 分别在接种0、24、36、48、72 h取离病斑0.5 cm外的H.11648叶片0.5 g，加入2 mL提前预冷的酶液提取液后于冰浴下研磨成浆，再加提取液冲洗2～3次（总体积为5 mL），转入离心管中，于4 ℃10 000 r/min下离心15 min，取上清液分装后于4 ℃保存备用。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参考孙云等[14]的方法，以每分钟氧化1 ?mol抗坏血酸（AsA）的酶量为一个酶活单位（U）。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参照南京建成公司的SOD试剂盒说明书进行，以每克鲜样中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD量为一个酶活单位（U）。过氧化氢酶（CAT）活性测定采用比色法，具体参照刘琳等[15]的方法，以每分钟内A240变化0.01为1个酶活性单位（U）。过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，具体参照邹琦[16]的方法进行，以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性测定分别参照Jiang等[17]和Sangeetha等[18]的方法进行。

1.3 数据处理

上述所有数据均采用SAS 9.0软件进行统计分析和差异显著性分析（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 H.11648接种烟草疫霉后的发病情况

分别在接种烟草疫霉24、36、48、72 h观察H.11648叶片发病情况，结果发现H.11648在接种24 h叶片开始褪绿（图1-b），接种36 h，肉眼可见有约0.9 cm的黄色病斑（图1-c），随着侵染时间的延长，病斑进一步扩大，颜色逐渐加深，接种72 h，可见深褐色轮纹状病斑，大小约2.5 cm（图1-e）。

2.2 H.11648接种烟草疫霉后的电镜观察

电镜观察表明，高感品种H.11648在接种0 h，细胞结构完整，叶绿体呈椭圆形或圆形，线粒体清晰可见（图2-A1、B1）；接种24 h，细胞内可见大量休止孢（图2-A2）和分泌物，叶绿体结构破坏，植物组织被降解；接种36 h，叶绿体和核结构进一步被破坏，植物组织降解更严重，可见大量的附着孢（图2-A3、B2）和少量的嗜锇粒，吸器形成（图2-B3）；接种48 h，可见大量分泌物，植物组织进一步降解（图2-A4）。接种72 h，细胞内出现大量的菌丝，叶绿体结构破坏，线粒体空泡化，有少量的淀粉粒和嗜锇粒，孢子囊内各细胞器结构完整（图2-A5、B5）。

2.3 H.11648接种烟草疫霉后抗氧化酶活性变化情况

H.11648在接种前（0 h）APX活性为（985.71±97.80） ?mol/（g.min），接种24 h达到最高，为（1 139.29±62.78） ?mol/（g.min）；接种36 h，APX活性最低，为（539.58±124.75） ?mol/（g.min）；接种48 h和72 h又恢复到正常活性水平；在整个接种过程中，接种36 h后APX活性显著低于接种前（0 h）和接种24 h。POD活性在接种前（0 h）为（361.83±57.88） U/（g.min），随着时间的延长，POD活性显著下降，接种36 h达到最低，为（50.63±2.23） U/（g.min），接種72 h又显著上升；在整个接种过程中，POD活性呈现先下降后上升趋势，并且接种前（0 h）POD活性显著高于接种72 h，接种72 h POD活性显著高于接种24、36、48 h。CAT活性在接种前（0 h）为（265.24±15.56） U/（g.min），接种24、36、48 h均略有上升，

接种72 h达到最高水平，为（501.44±25.73） U/（g.min），显著高于接种0、24、36、48 h 时的CAT活性。SOD活性在接种前（0 h）为（7752.51±792.80） U/g，随着时间的延长，SOD活性显著下降，在接种72 h达到最低，为（2888.62±351.09） U/g。PAL活性在接种前（0 h）为（15.56±3.07） U/（g.min），随着时间的延长，PAL活性逐渐上升，接种72 h达到最高，为（25.73±5.46） U/（g.min），显著高于其他4个时间点。PPO活性在整个接种过程中先上升后下降最后又上升，在接种前（0 h）为（929.82±36.32） U/（g.min），在接种72 h达到最高，为（1742.67±113.50） U/（g.min），显著高于其他4个时间点。接种24、36、48 h的PPO活性均显著高于接种前（0 h）。

3 讨论

电镜观察发现，剑麻H.11648在接种病原菌后，可先后观察到休止孢、附着孢以及吸器等典型的阶段，并可见大量的菌丝在细胞间隙间扩展；附着孢周围有大量的半球形分泌物出现。植物细胞中叶绿体结构破坏，植物组织被降解。在致病疫霉侵染感病马铃薯过程中，游动孢子先形成休止孢，休止孢萌发后形成附着孢，附着孢通过产生侵染钉穿透寄主的表皮角质层细胞壁进入寄主内[19]。寄生疫霉也是通过附着孢的方式侵染拟南芥[20]。从电镜观察结果推测，烟草疫霉也可能是通过附着孢侵染剑麻。同时叶绿体结构被破环，H.11648光合作用和能量代谢受到影响，而分泌物的出现则有利于病原菌更好的破坏植物组织，从中吸取营养，同时为其成功侵入剑麻组织提供帮助。

在接种36 h后可观察到H.11648细胞内吸器的形成，这在致病疫霉与感病马铃薯互作、寄生疫霉与拟南芥互作中均有报道[19-20]。以往的研究表明，真菌的吸器是宿主与病原菌营养物质吸收、交换和运输的主要界面，不仅可为病原菌生长和繁殖提供营养[21-23]，同时也是病原激发子运输的主要通道，是宿主与病原菌相互识别以及宿主防御反应启动的主要场所[24]。卵菌与真菌在植物病原互作中有类似的模式，因此推测，H.11648细胞内吸器的形成在烟草疫霉与剑麻互作过程中可能也有类似的功能。

本研究表明在烟草疫霉与剑麻H.11648互作过程中，PAL、PPO和CAT显著上升，POX、APX和SOD明显下降。PAL是植物次生产物如类黄酮、木质素等代谢中的关键酶，在烟草疫霉侵染过程中，PAL活性的增强可加快H.11648木质素的合成，使次生细胞壁的厚度增加，从而达到阻止烟草疫霉入侵，提高H.11648抗性的作用[25-28]，这与赵艳龙等[29]的研究结果基本一致。同样的，PPO活性增强不仅可以促进H.11648细胞壁厚度的增加，同时也可以产生有抗病作用的醌类物质[17，30]。CAT活性的增加则有利于维持H.11648细胞内H2O2的平衡，减少活性氧对细胞的伤害，从而提高H.11648对烟草疫霉的抗性。这与Fortunato等[31]的研究结果一致。而Magbanua等[32]则认为，CAT活性降低可以使H2O2维持在较高浓度水平，这样反过来可以增加植物对病原菌的耐受力，提高植物的抗性[33-34]。而SOD、POD和APX活性降低，产生的H2O2不能及时转化成H2O和O2，则使H.11648细胞内活性氧积累，尽管增加了H.11648对病原菌的耐受性，同时又加速了活性氧对细胞膜的伤害[35]，这也可能是导致H.11648感病的原因，这与Debona等[36]的研究结果相反。

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