重组单克隆抗体生产的宿主细胞系的研究进展

刘素霞

摘要：許多表达系统可以表达单克隆抗体，并且也在研究中。CHO细胞是最常用于研究的细胞系，直到今天仍然是单克隆抗体生产的主力。对宿主细胞系进行改造提高产品产量及质量，不同的宿主细胞系生产的产品质量存在差异。

关键词：中国仓鼠卵巢；单克隆抗体；哺乳动物表达系统

1 历史和科学背景

单克隆抗体（MonoclonalAntibody，mAb）在重组蛋白药物中占比最大，不仅可以用于人类疾病的治疗，还可用于多种疾病的体内成像诊断。

20世纪60年代，人们开始培养骨髓瘤细胞，并且通过化学或辐射方法处理后建立了营养缺陷型细胞株。1975年杂交瘤技术发表，制药行业很快意识到mAb将成为重磅炸弹。OKT3是第一个动物细胞生产的小鼠mAb，作用于人类T淋巴细胞，用于抑制肾移植手术后的异体排斥。

人们对转基因植物、转基因动物以及体外翻译系统已经研究了数十年，这些生产系统主要的难点是产品效价不足，另外，转基因植物常常存在多余的糖基化或蛋白水解活性，造成下游操作程序复杂、低效。

2 mAb生产的宿主细胞系

用于重组mAb表达的宿主细胞系主要是CHO，NS0，Sp2/0，HEK293和PER.C6。但是，被批准用于人类治疗mAbs生产的细胞系仅有CHO，NS0和Sp2/0。其中，CHO细胞占据了当今工业生产蛋白质药物的70%。[1]

1986年，首个重组生物药tPA被批准上市，CHO细胞作为其表达系统也成为重组蛋白表达的首选细胞系。目前，CHO细胞系的mAb生产工艺已经相当成熟，通常批次生产的产量最高可达到1 g/L，流加培养可达到110 g/L。[2]

鼠源细胞系的NS0和Sp2也可用于重组mAb生产，NS0细胞的细胞密度和mAb表达量通常会比CHO细胞的批次培养低10倍。HEK和PER.C6细胞可以表达与人类蛋白质糖基化一致的mAb，HEK293细胞尤其适用于瞬时基因表达，可以在DNA转染后几天内收获蛋白质。

3 mAb生产的宿主细胞工程

研究者们通过过量表达或敲除某个基因，调整代谢途径、延缓细胞凋亡、增强转录表达效率，有效的增加了重组蛋白产量。在重组 CHO 中表达酵母PYC2，可以改变流加培养方式中葡萄糖的代谢速率，增长细胞的对数生长期，从而增加细胞密度及产量。应用锌指结构核酸酶完全敲除CHO 细胞的Bak和Bax基因，IgG表达提高25倍。[3]

4 mAb生产中的“产品质量”

在不同细胞系统中表达的mAb的一级序列主要由转入基因的密码子决定，但翻译后修饰决定了重组蛋白质的微观不均一性，并对其溶解度，稳定性，药代动力学，效力和生物活性具有显着影响。

蛋白质的糖基化可影响蛋白质的药理活性、生理生化特性以及药代动力学性质，半乳糖基化对于介导补体依赖性细胞毒性（CDC）是相当重要的。α1，6岩藻糖基通过与FcγRIIIa受体的特异性抗体结合，从而在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）中起作用，CHO表达的mAb含有高达90%的岩藻糖化，通过基因工程改造使其缺乏α1，6岩藻糖基，可增加mAb的ADCC活性。唾液酸化有利于增加mAb的血清半衰期，但也有报道说末端唾液酸会减少ADCC活性。[4]

将mAb应用于体内之前，需要严格控制产品的质量，蛋白质的结构、环境条件或生产过程等因素使得重组蛋白在生产及储存过程中可能会发生聚集，形成较大颗粒，若是治疗性蛋白质可能会因此失去生物活性，甚至出现免疫反应或其他副作用。[5]

5 mAb生产的现有及先进技术

细胞培养技术在过去几十年里已经相当成熟，并逐渐发展成为一种相对可靠和强大的技术。大约30年前，“老”生物过程通常以分批模式运行一周，最大细胞浓度为3×106cells/ mL，重组蛋白产量约为100 mg/L。二十年后，由于改善了基础培养基以及补料策略，mAb表达量达到15g/L。现在，生产工艺得到进一步的发展，产品表达量可以超过10 g/L。

物理参数（例如温度，气体流量），化学参数（例如pH，渗透压，溶氧）和生物学参数（例如细胞密度，存活力，细胞周期）都会显着影响产品质量和生产效率，特别是对产品的糖基化，翻译后修饰水平和杂质类型方面有显著影响。要获得符合质量要求且产量高的mAb，培养操作参数的优化是极其重要的。

6 结论

大约75%的科学出版物从一开始就使用CHO细胞。因此，在接下来的几十年中，CHO细胞可能仍然是哺乳动物细胞培养中蛋白质表达的主力。与此同时，已经开展了许多替代表达系统的开发，特别是对于一些新形式或人工改造的mAb变体。只要它们能够达到期望的质量，甚至可以在低等真核生物或原核生物中表达。

参考文献：

[1]Valente KN，Levy NE，Lee KH.Applications of proteomic methods for CHO host cell protein characterization in biopharmaceutical manufacturing.Curr Opin Biotechnol.2018，53：144150.

[2]Wang W，Zheng W，Hu F，et al.Enhanced Biosynthesis Performance of Heterologous Proteins in CHOK1 Cells Using CRISPRCas9.ACS Synth Biol.2018，7（5）：12591268.

[3]Toussaint C，Henry O，Durocher Y.Metabolic engineering of CHO cells to alter lactate metabolism during fedbatch cultures.J.Biotechnol，2015，217：122131.

[4]黄嘉慧，汪才坤，覃锦红，等.N糖基化对TNFRFc融合蛋白结构稳定性和生物活性的影响.中国生物工程杂志，2016（5）：1219.

[5]李敏，常卫红.生物制品质量标准研究与建立一般原则的探讨.中国新药杂志，2017，26（16）：18871893.