利用正向重复片段的GUS报告基因检测DNA双链断裂引起的基因重组研究

鲍岳 张俊华 苏振华 曹雪松

摘 要：本研究建立了一种方便快捷地检测DNA双链断裂引起的基因重组的方法。传统的检测DNA双链断裂的方法较为复杂、繁琐。因此，构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。本研究构建了利用正向重复片段的GUS基因载体以及引导RNA和噬菌体MS2外壳蛋白偶联限制性核酸内切酶的基因组编辑系统，在GUS基因内部DNA重复区切割DNA，导致双链断裂（doublestrand breaks， DSBs），DSB经同源序列引导修复（homologydirected repair， HDR）途径，引起GUS基因重组，恢复其功能。此方法可以经过GUS染色后快速、直观地检测位点特异的DSB。通过GUS与其底物的反应，以达到半定量、直观快速检测DSB的目的。

关键词：GUS基因；DNA双链断裂；GUS染色；基因重组

中图分类号：Q784 文献标识码：A

AnEfficient Detecting System for Genes Recombination Caused by DNA Double

Strand Breaks Using Direct Reapeated Report Gene of GUS

Bao Yue Zhang Junhua Su Zhenhua Cao Xuesong*

College of Life Sciences Liaocheng University Shandong Liaocheng 252000

Abstract： In this study， a convenient and quick method for detecting gene recombination caused by DNA double strand breaks （doublestrand breaks，DSBs） was established. DNA DSBs can cause sitespecific homologydirected repair（HDR）. However， the traditional methods of detecting DNA DSBs are complicated and cumbersome. Consequently， it is necessary to develope such a simple and fast detection technique. This study was conducted by using the direct repeated GUS gene and guide RNA combined with phage MS2 coat protein coupled with restriction endonuclease genome editing system， in which gRNA is complementary with GUS repeat sequences. Based on producing DSBs， functional GUS gene can be restored via HDR. By using the staining reaction of GUS with its substrate， the results can be achieved and quantitative detection of DSBs can be established. This method can be used quickly to detect site specific DSBs and intuitively observe the results after GUS staining.

Key words： GUS gene； DNA double strand breaks； GUS staining； gene recombination

1 绪论

随着生命科学的研究和发展，数量繁多的基因或其调控因子的功能需要鉴定，作为研究基因功能最为有效的方法，定点基因突变研究越来越受到人们的关注，基因组编辑（genome editing， GE）技术应运而生。因此，建立一种高效而又精确的检测基因定点突变技术是十分必要的。而检测GE的前提是能够检测DSB，但是传统的检测DNA双链断裂的方法较为复杂、繁琐。因此，构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。近年来，伴随着不同的核酸酶以及DNA结合蛋白的结构和性質的阐明，基因组编辑技术已推广及其应用到许多生物中。将DNA结合蛋白的识别结构域和核酸酶的切割结构域相结合，实现对任意的特定DNA序列进行定点识别与切割。造成的DNA产生DSBs，后者通过两种DNA修复方式，一种是HDR，另一种是非同源末端连接（nonhomologous end joining， NHEJ）。HDR在有外源的同源DNA存在的情况下，能够实现对特定碱基的替换，即对点突变进行恢复。NHEJ则是在被切割处的DNA序列发生缺失或插入等的突变。目前被广泛应用的GE技术主要有人工介导的锌指核酸酶技术（zinc finger nuclease， ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶技术（transcription activatorlike effector nucleases， TALEN）和由RNA介导的规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）技术，DSB经过细胞内源性修复机制（HDR或NHEJ）的修复从而实现基因的插入、缺失和碱基替换等基因突变，以达到引起不同细胞系或生物体中的基因组发生改变的目的。再者，GE是能够破译基因功能和可以应用到基因治疗的一种有力工具。而在CRISPR /Cas系统中，Cas9核酸内切酶识别所必需的原间隔序列的3端含有的一个原间隔临近基序（protospacer adjacent motif，PAM），PAM区是CRISPR/Cas系统中Cas蛋白识别CRISPR的序列标记[1，2]，对双链进行切割。此外，最近的研究表明，该系统与ZFN和TALEN一样，可在非目标位点进行打靶，从而造成脱靶现象[3，4]。因此，对DNA双链断裂进行检测是研究GE产生及其效率的关键。DNA双链断裂的检测技术主要有以下几类。

1.1 γH2AX检测方法

DNA损伤及双链断裂的检测方法有很多，目前最为常用的是γH2AX检测方法。组蛋白2A变异体（histone family 2A variant， H2AX）属于核心组蛋白H2A家族中的一个亚型。DNA损伤及双链断裂后，产生磷酸化底物。这些DSBs都具有快速诱导H2AX的大量磷酸化（γH2AX）和簇集的功能[5]。所以，γH2AX可以作为DNA的损伤标记[6]，通过检测γH2AX，进而可以检测DNA双链断裂，该方法在药理学和临床医学领域均有应用。

迄今为止，已经开发了很多种技术和方法来检测γH2AX， Rogakou等在正常的细胞受到外源性的物理辐射后观察到H2AX发生磷酸化，并导致γH2AX斑点出现[7]；在γH2AX斑点形成后，观察斑点的数目与DSB的数量呈正相关[8，9]。据此有研究表明，由γH2AX焦点的数量推算出的辐射剂量与DNA的DSB的数量曲线中可以计算出，每一个已经完成培养的正常的细胞可以在每单位辐射剂量（Gy）的电离辐射下造成有3539个DNA的DSB损伤的出现[10]。而检测的方法主要包括（1）免疫荧光染色结合荧光显微镜分析方法：这个方法被应用于早期DNA损伤研究，主要利用荧光显微镜技术和显微镜成像技术[11]。如果是用人工进行分析，通过荧光显微镜检查是否有荧光标记的γH2AX 灶点。缺点在于人工进行操作，人为的观察可能会对实验结果造成影响和偏差较大[12，13]。如果是自动化分析，基于手动操作或者是全自动显微镜，对荧光染色并制成玻片标本的细胞拍照后，利用图像分析软件分析每个细胞核中的γH2AX 灶点的数目和分布以及它们的荧光强弱。利用自动化进行分析，相比较于人工分析，优点在于准确性高、结果更加可靠，而且相较于人工操作，自动化分析的速度更快，能够得出把所得的定量的结果直接进行图片保存，方便以后的分析[14]；（2）流式细胞术（ flow cytometry，FCM） 分析方法：使用流式细胞仪分析经过免疫荧光标记的细胞，能够分析每个细胞核中的荧光强度，甚至能够测定含有荧光的细胞所占的百分比是多少[15]。这种方法的优点就在于速度快，准确性高。但缺点也是非常显著的，由于被分析的细胞被破坏，无法分析每个细胞核中γH2AX 灶点个数和分布[16]；（3）全细胞酶联免疫反应（ Wholecell ELISA assay） 检测方法：这种检测方法所依据的原理是利用使用过氧化物酶结合的第二抗体去替代免疫细胞化学方法中的荧光分子结合的第二抗体，然后过氧化物酶与底物进行反应，能够产生一定量的显色产物，从而得到细胞内γH2AX的含量。这种操作方法的优点就在于操作简单、速度快。但缺点是不能准确分析每个细胞核内的γH2AX 灶点数量和分布数据[17]。

总之，利用γH2AX对DNA双链的断裂进行检测，方法较为复杂，操作比较繁琐。再者，有部分细胞活动并不导致DSBs的产生，但是仍然有可能产生γH2AX，因此有必要针对具体应用进行预实验，优化实验条件，并分析γH2AX产生的机制；第三，虽然检测到的γH2AX 含量和DSBs呈正相关关系，但不能精确计算出后者产生的数量。

1.2 荧光报告基因检测

还有一种方法是利用荧光报告基因来检测DSB。这种方法是通过构建突变的荧光蛋白载体来实现的。该技术又分为二类，一是构建在荧光蛋白基因内部插入含有终止密码DNA片段载体，当经过GE导致插入DNA片段产生突变后，一部分荧光蛋白基因的读码框恢复功能，因而可通过检测荧光来检测DSB[18]。但该方法只能检测到使荧光蛋白基因恢复读码框的突变，而其余的则不能检测到；第二类是构建含有重复DNA片段的荧光蛋白或其他报告基因的载体，当经过GE导致重复DNA片段产生突变后，经过HDR修复使荧光蛋白基因的读码框恢复功能，因而可通过检测荧光来检测DSB[19]。但目前该方法在植物突变研究中，主要在转基因植物中进行，实验耗时长。

1.3 GRATEN系统

我们构建了引导RNA偶联核酸内切酶（guided RNA and tethered endonuclease， GRATEN）引起DSB的技术，基于序列重叠的β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因[20]，通过HDR修复产生的基因突变进行恢复。GRATEN系统包含二个组分，一是串联的引导RNA （guided RNA， gRNA）和可与噬菌体MS2外壳蛋白（MS2 coat protein， MCP）结合的RNA；另一部分是融合的MCP和核酸内切酶FokI切割结构域基因。该系统的工作原理是，当gRNA与基因组的同源DNA配对形成R环（Rloop）结构后，与MCP结合的RNA通过将FokI引导至Rloop邻接区域，二聚体化的FokI切割DNA形成DSB，导致GE的产生（图A）。为了验证GRATEN系统产生DSB的可能性，我们在植物表达载体中构建了含有部分重复序列的GUS基因（35SGUUS）。通过在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时共表达GRATEN和35SGUUS，GUS基因得到恢复。证明GRATEN导致序列特异性DSB以及利用35SGUUS检测DSB是切实可行的。

Figure A： GRATEN system[HT]

GRATEN系统载体的构建：在TNPs模块中，浅蓝色部分为花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子；核定位信号（NLS）（紫色部分）；核酸內切酶FokI（粉色部分）；噬菌体外壳蛋白MCP（黄色部分）；胭脂氨酸合成酶的转录终止子Tons（灰色部分）；在gRNA模块中，5'端的发夹结构以蓝色矩形表示、MCP binding以棕色矩形表示、gRNA以红色矩形表示；拟南芥Pol III启动子（AtU6）；5'端的发夹结构（Hp）；三个结合MS2的位点（3XMS2 binding）；对应基因组靶位点的gRNA（Target）；终止AtU6启动的翻译终止子，8个胸腺嘧啶（8T）。

Schematic of GRATEN system. In the TNPs， 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV） in white； nuclear localization signal （NLS） in purple； endonuclease FokI in pink； MS2 bacteriophage coat protein （MCP） in yellow； transcriptional terminator of nopaline synthase gene（Tnos） in gray； In the gRNA， the 5 end hairpin， gRNA and MCP binding sites are denoted in blue， red and brown lines respectively. AtU6， promoter of polymerase III from Arabidopsis thaliana； Hp， 5 end hairpin structure； 3×MS2 binding， triple MS2 binding sites； Target， target sequence in genomic locus. 8T， octuple thymines for terminating transcription driven by U6 promoter.

2 材料和方法

2.1 GRATEN系统的构建

我们所构建的GRATEN系统，是由以下原件组成：① Pol III启动子。将编码gRNA的DNA克隆到该启动子下游，其中gRNA是针对目标DNA设计的；②FokIMS2FokI融合基因克隆。将FokIMS2FokI三个基因片段串联，二端加上核定位信号（Nuclear Localization Signal， NLS），并在C端加6×His标签。将以上串联的基因克隆到植物表达载体35S启动子下。上述克隆经DNA测序验证。如图A所示，MS2蛋白可以形成同源二聚体结构，这个同源二聚体结构首尾反向平行，在MCP的两端连接FokI限制性核酸内切酶，形成一个结构形式为FokIMS2FokI的融合蛋白，命名为偶联核酸融合蛋白（tethernuclease fusion proteins，TNPs），所形成的这个二聚体会在靶DNA的RLoop结构上游对DNA进行切割，造成DSBs。而在我们的实验中，就是对GUUS的重复片段进行切割，切割完成后，通过HDR途径恢复成有功能的GUS基因，然后，利用GUS基因的特性进行检测。

我们的模板选择载体质粒pBluescript II KSGUS1进行PCR的扩增，NGUS5和NGUR作为扩增引物，然后进行琼脂糖凝膠电泳检测，能够检测到扩增产物为1035bp的GUS1片段（图B）；我们的另外一个扩增是以NUSF和NGUS3为引物，以载体质粒pBSGUUS为模板，检测到扩增产物为1413bp的GUS2片段（图C）；若载体变为Nco I和Bste II双酶切载体质粒pBSGUUS，则是2423bp的GUUS片段（图D）；以载体质粒p1305GUUS为模板，以NGUS5和NGUS3为引物进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得到2423bp的GUUS片段（图E）。

2.2 植物材料及转基因操作

实验材料选择生长状况良好的本氏（Nicotiana Benthamiana， N. Benthamiana）烟草植株。

将构建的重组载体质粒与对照共同转化农杆菌，将含表达载体的农杆菌转接种于LB液体培养基培养直至对数生长期，离心收集菌体，然后加入渗透注射缓冲液，重悬至OD600 值约为 0.5～1.0，遮光条件下室温静置 2～3 hrs后用于渗透注射。渗透注射苗龄为4周左右的烟草叶片，采用农杆菌渗入法侵染烟草叶片，用针头在植株叶片上扎两个孔，用无针头的注射器对叶片进行注射，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间，实现农杆菌介导的植物瞬时表达。渗透注射后的烟草植株在弱光条件下培养一天，然后放于可见光下正常培养，瞬时表达48h后取材进行实验。

2.3 GUS染色及观察

GUSRec系统的工作原理（详见图F），我们通过将构建的载体质粒与p1305GUUS载体质粒转化农杆菌，共同渗透注射4周左右苗龄的烟草叶片，进行农杆菌植物瞬时表达，培养三天后剪下叶片进行GUS染色和观察。

（1）GUUS表达载体。35S及NOST分别为启动蛋白表达的启动子和终止子，两个灰色方框（U）表示GUS基因内部重复片段，gRNA的识别和切割序列用箭头来表示；（2） GUSRec与我们所设计的载体共同表达，经gRNA引导并经TNP切割产生DSB，GUS基因内部重复片段间经同源链交换重组；（3）GUS基因恢复正常阅读框。

（1）GUUS expression vector. 35S and NOST are promoter and terminator for gene transcription respectively， two gray boxes （U） represent the direct repeats of intenal GUS gene， gRNA recognition and cleavage sequence represented by arrows. （2）GUSRec and the vector are expressed in one cell simultaneously， after gRNA guiding and cleavaged by TNP ， producing DSB， GUS gene can be restored between direct repeat sequences by singlestrand invasion， strand exchange and homologous recombination.（ 3）GUS gene recover to normal reading frame.

3 结果

观察瞬时表达GUS，得到了以下的结果：空载体瞬时表达后，经GUS染色后没有颜色（如图G1）；以gRNA作对照，经GUS染色后没有颜色（如图G2）；GUS表达体瞬时表达后，经GUS染色呈现出蓝色（如图G4）；只转化p1305GUUS载体质粒的叶片，经GUS染色后不会出现蓝色（如图G3）；共同转化p1305gRNAFMF载体与p1305GUUS载体，能够瞬时表达GUS，经GUS染色后呈现出部分蓝色（如图G5），为了避免因叶片状态对瞬时表达造成的影响，观察同一叶片瞬时表达，如图G6。说明GUUS基因经切割重组后恢复为正常读码框的GUS基因，并翻译成GUS蛋白。并且这种发生在GUS基因内部重复区的位点特异性双链断裂是由gRNA引导的，而且是由二聚体FokI切割产生的。因此我们证明我们设计的GRATEN系统能够在特定位点进行切割，并且由切割产生的DSB及其经HDR修复的效率较高（约为35%），该技术系统可用于快速检测基因组编辑产生的特异位点DNA切割及其HDR修复。

4 结论

利用报告基因检测位点特异性DSB不仅可用于验证GE致突变的特异性和效率，而且可研究各种生物和非生物致突变剂对DNA的损伤程度，同时也可研究动植物在生理条件下产生DSB及其损伤修复机制。已有的检测DNA的DSB技术存在以下缺点：（1）操作步骤繁琐。如γH2AX检测方法；（2）结果不稳定。如利用荧光报告基因进行的检测，一是需要荧光显微镜。二是在进行检测时，在紫外光下荧光会迅速产生淬灭，对精确统计结果有影响；三是植物细胞会产生自发荧光，对结果存在干扰；（3）植物中尚缺乏快速、稳定检测方法。植物中利用GUUS系统只运用于转基因植物的DSB及其DNA重组研究，尚未发现利用其檢测基因瞬时表达的研究。我们的实验结果具有以下的优点：（1） 实验步骤简单，得到结果较快。整个实验过程只需23天即可得到结果。相较于转基因植物具有较高的效率，并且可作为后者的先期验证性实验；（2）GUS染色稳定，结果重复率高；（3） GUS染色是经 β葡萄糖醛酸酶（betaglucuronidase）催化底物5溴4氯3吲哚β葡萄糖苷酸（XGluc）而产生蓝色反应物，由于酶促反应具有较高的效率，因此我们推测利用GUS基因恢复技术可检测发生频率较低的基因组DSB；（4）首次发现GRATEN系统可产生位点特异性的DSB，并且其切割DNA效率较高。该系统具有以下特点：（1）设计、构建打靶载体简单。因为与MCP结合RNA以及MCP：FokI融合蛋白只需构建一次，只需将针对特定基因组序列的gRNA构建到载体中U6启动子的下游。（2）系统作用效率高。由于gRNA与MCP：FokI融合蛋白在同一载体上，可实现在同一细胞中同时高效表达以上二个组分及其产生作用的目的，避免了因RNA和蛋白分别在二个载体表达，从而需要共同侵染植物而产生的共表达效率低的弊端。

作者贡献：

曹雪松老师负责实验的设计，鲍岳主要负责实验的完成和数据的分析以及论文的撰写，张俊华和苏振华负责实验的协助进行，全体作者阅读并同意全文。

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基金項目： 项目来源“基于CRISPR/Cas系统的新型植物基因组编辑技术研究”（No：31370387）

作者简介：第一作者鲍岳（1993），女，山东聊城人，硕士，研究方向：基因组编辑。

*通讯作者：曹雪松（1962），男，安徽人，博士研究生，教授，研究方向：基因组编辑。