拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NRRL—B593在三种不同培养基中乙醇脱氢酶活力的测定

朱晓 邹琪琪 张锋

摘 要：拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii〗）NRRL-B593在葡萄糖基質中可以代谢产生丁醇、乙醇、异丙醇。乙醇脱氢酶（ADH）是产生醇类的关键酶，比较了拜氏梭菌（C. beijerinckii）NRRL-B593在葡萄糖基质与氨基酸基质中ADH活性，为进一步研究该菌株的代谢及表达调控提供理论基础。首先通过监测C.beijerinckii NRRL-B593在不同培养基中D600值，绘制生长曲线，后在8000 r/min，10min下收集对数期与稳定期的细胞，利用厌氧型细胞破碎仪French Press获得无细胞抽提物（CFE），最后通过Bradford法测量蛋白质含量，在厌氧条件下利用丙酮为底物，NADPH依赖型的氧化反应测其酶活力。结果显示，稳定期的ADH酶活力远远高于对数期酶活力高，氨基酸培养基中的ADH酶活力高于葡萄糖培养基。

关键词：拜氏梭菌；乙醇脱氢酶；代谢；培养基

中图分类号：Q93文献标识码：A

Abstract：Clostridium beijerinckii NRRL-B593 grows on glucose and is capable of producing butanol， ethanol and isopropanol. Alcohol dehydrogenase （ADH） is a key enzyme catalyzing the production of alcohols.This article compared its ADH activities when it would grow on carbohydrates and peptides，and did the foundation for futher studying AHD. Clostridium beijerinckii NRRL-B593growth was monitored using optical density at 600 nm. The growth curves were obtained using different substrates. Cells grown at log phase and stationary phase were harvested using centrifugation（8000×g，10mins）， and cell free extract （CFE） was prepared using a French Press. Protein concentration was determined using the Bio-Rad assay.The ADH activity was measured under anaerobic conditions following the acetone-dependent oxidation of NADPH.ADH activity in the CFE fromC. beijerinckii NRRL-B593 cells grown on tryptone was higher than that from the cells grown on glucose.

Keywords：Clostridium beijerinckii NRRL-B593；ADH；metabolism； substrates

在C. beijerinckii所有菌株中，乙醇脱氢酶负责催化产生丁醇和乙醇，而有些菌株像C. beijerinckii NRRL-B593能利用乙醇脱氢酶催化丙酮产生异丙醇[1]，这些代谢产物在工业、食品行业、医药行业中应用广泛，而且乙醇脱氢酶可用于医学分析、工业生产等方面[2]。目前我国高纯度的乙醇脱氢酶尚需依赖进口，价格昂贵。通过微生物发酵获取乙醇脱氢酶，是实现其大规模化生产的一条重要途径[3]。乙醇脱氢酶是一种含锌金属酶，其活性位点含有两个反应性巯基以及一个组氨酸残基，需要NAD （H）、NADP（H）作辅酶转移电子进行催化反应，而在C. beijerinckii NRRL-B593中依靠NADPH作为辅酶[4]，是醇类代谢的关键酶。国内外文献已经报道对Clostridium beijerinckii NRRL-B593在葡萄糖基质中酶活力的研究，YAN[5]等人利用混合培养基测得乙醇脱氢酶活力（丙酮反应成异丙醇）最高为0.25μmol·min-1·mg-1，但是在无葡萄糖培养基例如蛋白胨培养基中C.beijerinckii NRRL-B593的ADH的酶活力的研究尚未见报道。实验比较了该菌株在三种不同培养基中ADH酶活力，为深入研究该菌株的代谢及ADH酶活性提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NRRL-B593来自于加拿大滑铁卢大学生物系实验室。

混合培养基：蛋白胨5g/L，酵母浸出液10g/L，葡萄糖5g/L，无机盐溶液40mL/L，刃天青0.001g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5g/L。

葡萄糖培养基：葡萄糖60g/L，无机盐溶液40mL/L，刃天青1mg/L。

蛋白胨培养基：蛋白胨20g/L，无机盐溶液40mL/L，刃天青1mg/L。

MBI Sigma 3-18K离心机，Manifold，厌氧破碎细胞仪French Press FA-078A 120 VAC，60 Hz（美国fisher scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将上述三种不同培养基分别倒入100mL小瓶中，121℃下 20min灭菌，在Manifold中脱气1h，后打开氮气罐注入氮气 7min，然后脱气7min，循环3次，确保瓶中的氧气被氮气取代。从Manifold上取下小瓶，最后加入L-cysteine-HCl，溶液由红色变为淡黄色或者无色，证明瓶中处于无氧状态，调整pH到7，接入1%菌液（混合培养基中对数时期细胞），30℃恒温培养，测定D600，获得不同培养基的生长曲线（见图1）。

1.2.2 收集细胞及ADH酶活力的测定

收集对数期和稳定期时期的细胞，将菌液倒入50ml离心管，4℃，8000 r/min，10min离心，收集细胞，1g菌体加入到5ml已脱气的溶菌液中，继续脱气进气，使瓶中充满氮气，利用厌氧细胞破碎仪破碎细胞，后以丙酮作底物，NADPH做辅酶测其ADH酶活力。

Acetone + NADPH + H+ NADP+ + H2O + 2-propanol

[JP+1]带塞比色皿提前脱气2min后进气2min，重复两次，与分光光度计相连的水浴锅，提前调到45℃。首先将已脱气的测量缓冲液2mL加入到带塞比色皿中，放入分光光度计中预热到45℃，然后加入20 μL 1M丙酮溶液和40 μL 0.2mM NADPH溶液，混匀后加入100 μL无细胞抽提物，快速混匀后放入恒温分光光度计中，每隔10s连续测量3min 340nm下的吸光光度值，无丙酮或者无NADPH作为阴性对照，计算ADH酶活力[6]。

ADH 酶活力的定义（U）：在45℃，pH 7.5下，每分钟转化1μM NADPH变为异丙醇称为一个酶活力单位

1.2.3 Bradford法测蛋白质浓度

Bradford[7]法用来测定溶菌细胞液的蛋白质含量，100μL溶菌细胞液13000 r/min，5min离心后取上清液，取10μL无细胞抽提物置于离心管中，加入790μL无菌水，200μL BioRad，室温下30min后测其595nm下的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 该菌株在不同培养基中的生长曲线

从图中可见，在葡萄糖基质中生长最慢，在混合培养基中生长最快，蛋白胨培养基介于中间。

2.1.2 该菌株在混合培养基中稳定期和对数期的ADH酶活力大小

由于混合培养基中的细胞更容易收集，以在混合培养基为例，比较稳定期与对数期的酶活力，由图可见稳定期吸光值下降很快，比酶活力分别为0.172U/mg，0.0386U/mg。

酶活力 = U =ΔA340/minx加样总体积（mL）6.22x样品体积（mL）

比酶活力 = U/mg=U（总活力）蛋白质含量（mg）

酶比活力是指每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数

2.1.3 该菌株在不同培养基中的稳定期ADH酶活力的大小

在以上优化条件的基础上，比较不同培养基的酶活力，由图可见，三种培养基在340nm下吸光值变化较为一致，比酶活力分别为0.172U/mg，0.137U/mg，0.107U/mg。综上所述，蛋白胨培养基中的酶活力高于葡萄糖基质中的ADH酶活力，但低于混合培养基。说明C. beijerinckii NRRL-B593能利用蛋白质生成丙酮酸，进而形成醇类等代谢产物，后续实验将比较不同培养基的ADH酶活力与代谢产物之间的关系。

3 讨论

结果显示Clostridium beijerinckii NRRL-B593在混合培养基中生长最快，蛋白胨培养基介于中间，在全葡萄糖培养基中生长最缓慢。说明蛋白质培养基相比葡萄糖培养基更利于该菌株的生长，而混合培养基中兼有糖类与蛋白质，满足了该菌株生长所需要的所有的营养成分，因此在混合培养基中的生长速度最优。

该菌株在稳定期ADH酶活力远远高于对数时期酶活力。说明该菌株在稳定时期更易积累代谢产物。通过比较三种培养基中ADH酶活力的大小，蛋白胨培养基中的酶活力要高于葡糖糖基质中的酶活力，酶比活力达0.137U/mg，说明蛋白胨培养基更适于该菌株的代谢，可以为以后发酵利用蛋白质废弃物和获得高产ADH酶提供良好的理论依据。

参考文献：

[1]Kasap， M.Nitrogen metabolism and solvent production in Clostridium beijerinckii B593.Dissertation：Virginia Polytechnic Institute and State University.2002.

[2] Hiu， S.F.， Zhu， C.X.， Yan， R.T.， and Chen， J.S.Butanol-Ethanol Dehydrogenase and Butanol-Ethanol-Isopropanol Dehydrogenase： Different Alcohol Dehydrogenases in Two Strains of Clostridium beijerinckii （Clostridium butylicum）. Appl. and Environ. Microbiol.1987，53（4）： 697-703.

[3]孫珊，汪维云.一株拜氏梭菌利用甘蔗废糖蜜发酵生产丙酮丁醇[D].生物加工过程，2012，10（03）：6-11.

[4]Chen， J.S.Alcohol dehydrogenase： multiplicity and relatedness in the solvent-producing clostridia. FEMS microbiology reviews，1995，17（3）： 263-273.

[5]RUN-TAO YAN，CHANG-XIZHU.Expression of Solvent-Forming Enzyme and Onset of Solvent Production in Batch Cultures of Clostridium beijerinckii.Applied and Environmental Microbiology.1988，54（3）：642-648.

[6] Ismaiel， A.A.， Zhu， C.X.， Colby， G.D.， Chen， J.S.Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of C. beijerinckii. Journal of Bacteriology，1993，175（16）： 5097-5105.

[7] Bradford， M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.1976，72： 248-254.

作者简介：朱晓（1991-），女，硕士，主要研究方向：微生物发酵。