基因检测在肿瘤精准药学中的意义

郭子寒 杜琼 戴贤春 刘莹莹 余波 翟青

摘 要 肿瘤是发病率和致死率最高的疾病之一，其发生发展与基因突变导致的机体局部组织细胞异常增生有关。对肿瘤相关基因进行检测在肿瘤的诊断、预防和治疗中具有重要意义。

关键词 肿瘤 基因检测 意义

中图分类号：R730.5 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2018）05-0014-09

The significance of genetic testing for tumor precision medicine

GUO Zihan1，2，3， DU Qiong1，2，3， DAI Xianchun3， LIU Yingying3， YU Bo1，2，3， ZHAI Qing1，2，3*

（1. Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China； 2. Department of Pharmacy， Fudan University Shanghai Cancer Center， Shanghai 200032， China； 3. Proton and Heavy Ion Center， Fudan University Shanghai Cancer Center， Shanghai 201321， China）

ABSTRACT Tumor is one of the diseases with highest morbidity and mortality and its occurrence and development are related to the abnormal cell proliferation in the local tissues due to gene mutations. Genetic testing has important implications for the diagnosis， prevention and treatment of tumors.

KEY WORDS tumor； genetic testing； significance

基因是負载特定遗传信息的DNA或RNA分子片段。基因突变是基因在分子结构上发生的碱基对的组成或排列顺序的改变，包括点突变、移码突变、缺失突变和插入突变四种。基因检测是一种通过测序等手段对人体外周血、或组织中基因位点进行检测。研究表明，肿瘤是环境因素和遗传因素共同作用的结果，肿瘤相关的基因突变后，其表达蛋白的量或结构发生改变，导致局部组织细胞异常增殖，从而形成肿瘤。通过对人体的肿瘤相关基因进行检测，分析其基因突变情况，对肿瘤的筛查，临床诊断、治疗和预后的评估等具有重要意义。本文将对临床常见肿瘤的基因检测的现状、意义做和检测技术进行综述。

1 肺癌

GLOBOCAN 2012年最新发布的数据显示，肺癌的新发病例数约为180万，占总病例的12.9%，死亡率约为19.4%，居恶性肿瘤死亡率的第一位[1-2]，研究表明肺癌的发生发展及耐药可能与基因突变有关，如EGFR、KRAS、ROS1、c-MET等。

1.1 EGFR

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，位于细胞膜表面，通过与配体（EGF及TGFα）结合激活，从而引导下游通路（MAPK、AKT及JNK）磷酸化，诱导细胞增殖。许多实体肿瘤中，EGFR存在高表达或异常表达，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关[3]。

非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）患者中，最常见的EGFR突变是外显子19缺失突变（占45%）及外显子21点（L858R）突变（占40%）。上述两种突变对小分子酪氨酸酶抑制剂（tyrosine kinase，TKIs）具有敏感性，也被称为EGFR敏感突变[4]。EGFR敏感突变在NSCLC白种人患者中占10%，而在亚洲人中高达50%[5]。临床上对EGFR敏感突变的NSCLC患者所使用的一线治疗靶向药物有厄洛替尼、吉非替尼及阿法替尼。与传统化疗比，靶向药物疗效显著提高了，且副作用较轻[6]。一项回顾性研究表明，EGFR敏感突变的NSCLC患者使用厄洛替尼单药治疗后，客观缓解率为80%、中位PFS为13个月[7]。研究表明EGFR-TKI耐药后，50%会发生T790M突变[8]。奥希替尼（AZD9291）通过C797氨基酸共价键不可逆地结合EGFR的某些突变形式（L858R，外显子19缺失和含有T790M的双重突变体），抑制DNA合成和增殖。最新的AURA Ⅲ期研究比较奥西替尼和培美曲塞联合顺铂治疗在TM790阳性的肺腺癌疗效的结果显示，奥西替尼组无进展生存期（progression-free survival，PFS）显著高于化疗组（10.1个月vs 4.4个月），客观缓解率（objective response rate，ORR）也显著高于化疗组（71% vs 31%）[9]。

EGFR的基因检测在临床上多采用直接测序法（测定外显子18至219），聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism，PCRSSCP），微数字PCR（microfluidics digital，PCR），探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）等[5]。

1.2 KRAS

鼠肉瘤病毒原癌基因同源体（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）是RAS家族与人类肿瘤相关的基因之一，位于12号染色体，参与胞内信号传递。当KRAS突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控癌变。数据显示，KARS在北美腺癌患者的突变率为25%，是很常见的突变[10]。KRAS突变的发生与吸烟有关[11]。发生KARS突变的患者生存期较野生型KRAS患者短；因此KRAS突变是预后的分子标识[12]。值得注意的是，KRAS突变与EGFR-TKIs的疗效相关，其出现预示着EGFR靶向治疗的预后较差[10]。

1.3 ALK

间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是受体分子中的一员。正常情况下，ALK接受外部信息后活化，传递信息至细胞内并指导细胞有序生长增殖；由于某些异常（ALK重排等），长期处于过度活跃状态，持续传递增殖信号，导致肿瘤发生。ALK基因重排率在NSCLC患者中约为2%～7%[13]。ALK基因重排的NSCLC患者其临床特征与EGFR突变的患者相似（如病理组织为腺癌、非吸烟者或轻度吸烟者等），但是对EGFR-TKIs不敏感[14]。

克唑替尼是治疗发生ALK重排晚期NSCLC患者的首选药物，包括在脑转移患者中都具有较高（>60%）的缓解率[15]。一项3期临床试验比较了克唑替尼联合或不联合化疗（培美曲塞+铂类药物），缓解率分别为74%和45%，中位无进展生存期（PFS）及生活质量在联合组都有显著增加[16]。对于疾病进展（克唑替尼耐药）的NSCLC患者，色瑞替尼和艾乐替尼是美国食品及药物管理局（FDA）推荐的靶向药物，其治疗克唑替尼耐药NSCLC患者的缓解率和中位PFS分别为56% vs 50%，7月 vs 11.2月[17-19]。

1.4 ROS1

原癌基因1酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1），是一种跨膜受体酪氨酸激酶基因。与ALK异常的原理类似，ROS1重排会使细胞长期处于增殖状态，导致癌变。ROS1基因重排率在NSCLC患者中约为1%～2%；该重排倾向于在较年轻女性、非吸烟、腺癌患者与三阴性（EGFR突变、KRAS突变和ALK重排阴性）NSCLC患者中发生[20]。

用于治疗ALK重排的克唑替尼对ROS1重排的NSCLC患者同样有效，也是FDA推荐治疗的药物。一项研究表明，在发生ROS1重排的NSCLC患者中使用克唑替尼，缓解率达66%，中位PFS达18月[21]。

ALK与ROS1重排经FDA批准用于临床的标准检测方法为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）。除此以外，在仪器允许的情况下，免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）与高通量测序（next generation sequencing，NGS）也是可选的检测方法[22]。

1.5 PD-1/PD-L1

程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）是一種免疫抑制分子，表达在T细胞表面，调控其在外周组织的活性。PD-1有两种配体程序性死亡受体-配体（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）和PD-L2，它们在许多免疫效应细胞、抗原呈递细胞和肿瘤细胞中均有表达。肿瘤细胞上的PD-L1通过结合PD-1产生一系列作用导致T细胞失活、增殖减少。

治疗在于靶向针对PD-1或PD-L1从而阻断NSCLC患者肿瘤细胞对免疫细胞的抑制。NCCN所推荐的免疫治疗药物有派姆单抗（pembrolizumab）和纳武单抗（nivolumab）。临床研究Checkmate 057显示：纳武单抗对比多西他赛治疗晚期NSCLC患者的中位总生存期（Overall survival，OS）为12.2月 vs 9.4月[23]。另一项keynote 010显示：派姆单抗对比多西他赛治疗晚期NSCLC患者的中位OS为12.7月vs 8.5月[24]。PORLAR研究显示：atezolizumab对比多西他赛治疗晚期NSCLC患者的中位OS为12.6月vs 9.7月[25]。

美国加利福尼亚大学Garon等[24]报告，派姆单抗用于非小细胞肺癌患者疗效的提高与PD-L1在肿瘤细胞中的表达超过50%相关，一项单臂Ⅱ期膀胱癌的临床研究IMvigor 210显示[26]，PD-L1阳性的患者使用PD-L1抑制剂（atezolizumab）缓解率为26%；而对于PD-L1阴性的患者，缓解率仅为9.5%。提示检测PD-L1表达状态可能有临床指导意义。PD-L1的表达状态主要是通过IHC方法检测细胞表面受体数量来判定，主要的检测抗体有Dako22C3、Dako28-8、 VentanaSP14，每种检测所用到的抗体和具体技术都不同，且缺乏统一标准。PD-L1的表达水平是否可作为用药的筛选依据，仍需要高质量的临床试验加以验证。

2 乳腺癌

基因检测对于乳腺癌的预后判断和治疗方案选择具有重要的参考意义，乳腺癌的基因检测包括单基因检测如雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、癌基因人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）/细胞增殖核抗原（nuclear-associated antigen Ki- 67，Ki-67）表达水平、乳腺癌1号基因（breast cancer 1，BRCA）和多基因检测如MammaPrint、PAM50、OncotypeDX等。

2.1 ER、PR、Ki-67和HER2

乳腺癌中，HER2的阳性率达到15%～30%，绝经前ER的阳性率为54%，绝经后ER的阳性率高达73%[27]，ER阳性、HER2阴性常提示预后良好但可能对化疗不敏感[28]，而细胞增殖标记物Ki-67的高表达则相反，常提示预后不良但对化疗敏感。而不同的临床病理学特征和基因检测指标的预测能力存在不同程度的差别，如淋巴结阳性的预测能力强于HER2。同一个基因在不同的乳腺癌亚型的预测价值也不相同，如Ki-67对ER阳性乳腺癌预后和化疗敏感性的预测能力强于三阴性乳腺癌。

FDA批准用于ER或PR阳性乳腺癌患者治疗的药物有选择性雌激素受体调变剂：他莫昔芬、托瑞米粉和氟维司群，非甾体芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、来曲唑、阿那曲唑和甾体类芳香化酶抑制剂：福美司坦、依西美坦。用于晚期或转移性乳腺癌HER2阳性的药物有：曲妥珠单抗、拉帕替尼和帕妥珠单抗，曲妥珠单抗反应率为50%[29]，拉帕替尼联合卡培他滨的有效率为22%[30]。

HER2检测的常用方法主要为IHC和FISH。IHC通过检测细胞表面受体数量来判定HER2的表达状态。目前通过FDA认证的2种检测HER2表达情况的测试分别为Dako Hercep测试（使用多克隆抗体A085）及Ventana公司的Pathway（使用单克隆抗体4B5）。其检测结果解读[32]：①IHC阳性：+++；②IHC状态可疑：++；③IHC阴性。FISH是指通过测定基因拷贝数量来测定HER2状态。目前获得FDA许可的分别是：INFORM HER-2 test（Ventana Medical Systems）、PathVysion HER 2FISH test（Vysis，Downers Grove，IL）、the PharmaDX HER- 2FISH- test（DAKO，Glostrup，Denmark）。结果解读为[31]：①HER2阳性：FISH比率>2.2或HER2基因拷贝数>6.0；②HER2状态可疑：FISH比率是1.8～2.2或HER2基因拷贝数在4.0～6.0之间；③HER2阴性：FISH比率<1.8或HER2基因拷贝数<4.0。

2.2 BRCA

BRCA是乳腺癌易感基因，研究表明家族性乳腺癌约有10%～20%存在BRCA突变，而且BRCA突变患者患癌风险增加，可达40%～80%[32]，且BRCA突变的乳腺癌更易扩散，预后不良。于突变患者可采取：加强监测（乳房自检、X光检查和乳腺磁共振成像）、药物预防（选择性雌激素受体调节剂、芳香化酶抑制剂和激素避孕）及预防性手术[33]。多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂是BRCA突变的乳腺癌治疗的一种选择。rucaparib能有效延长BRCA突变的乳腺癌的生存期，口服rucaparib的有效率为15%[34]，FDA于2015年授予其突破性药物认证。指南建议对乳腺癌高危人群进行BRCA基因筛查。常用的检测手段有PCR-SSCP和NDA直接测序。

2.3 MammaPrint（70基因检测）

MammaPrint是2002年由荷兰癌症研究院开发的基于cDNA高通量的乳腺癌多基因检测系统[35]，是首个被FDA和欧盟批准的作为年龄<60岁、Ⅰ～Ⅱ期、淋巴结阴性或1～3阳性的乳腺癌多基因检测辅助预后分析系统。采用新鲜组织样本或固定石蜡包埋组织样本进行检测，依据检测结果将患者分为低风险组和高风险组，高风险组临床获益更高。

2.4 Prosigna（50基因检测）

Prosigna是采用逆转录多聚合酶链式反应检测乳腺癌50基因的技术，2013年FDA批准用于乳腺癌术后风险评估[36]，这一多基因检测系统主要用于估计Ⅰ～Ⅱ期ER阳性绝经后乳腺癌患者接受辅助内分泌治疗的无远处转移生存期。它通过复发风险分数（ROR）将检测结果分为低危、中危和高危组来预测患者预后。

2.5 Oncotype DX（21基因检测）

Oncotype DX由美国Genomic Health公司研发，ER阳性乳腺癌患者预后多基因检测方法，采用逆转录多聚合酶链式反应检测乳腺癌21基因[37]。21基因含有16个肿瘤相关基因和5个参比基因，将5个参考基因的Ct均值与16个相关基因的Ct值差值代入公式，转换为复发评分（RS）。依据分值可分为三组：低复发风险组，RS<18；中復发风险组，RS为18～31；高复发风险组，RS>31。高复发风险组可在化疗中获益[36]。中复发风险组能否在化疗中获益，尚在研究中。

3 胃癌

分子靶向药用于胃癌的研究很多，如EGFR、间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）、HER2、（血管内皮细胞生长因子受体，vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和免疫检查点等，但目前为止NCCN指南中有明确推荐的仅有曲妥珠单抗和雷莫芦单抗两个药物，分别靶向HER2和VEGFR。

3.1 HER2

胃癌中HER2的扩增率为7.1%～42.6%[38-42]，HER2基因的大量扩增会激活多种信号转导途径，使细胞大量增殖，易出现远处转移，是预后不佳的指标[43]。

ToGA试验[44]是第一项曲妥珠单抗用于HER2扩增的胃癌的大型Ⅲ期临床试验。在HER2扩增的患者中，顺铂-氟尿嘧啶联合方案联用曲妥珠单抗相比于单用化疗，显著提高中位OS（13.8月vs 11月，P=0.046）。

HER2检测方法及结果解读同乳腺癌。

4 结直肠癌

在结直肠癌的发生、发展中，很多基因起到了至关重要的作用，其中KRAS/NRAS突变、BRAF 基因突变等已被列入NCCN等各大指南中。

4.1 KRAS

KRAS是EGFR信号传导通路中一个重要的下游调控基因，KRAS突变通过自身激活启动下游信号的转导，使得EGFR介导的信号途径持续激活，从而导致抗EGFR单克隆抗体治疗转移性结直肠癌效果不佳，成为结直肠癌预后不良的指标[45-48]。国内外的研究显示，结直肠癌患者中KRAS基因突变频率从27.4%～44.5%不等[47-49]。

KRAS突变往往提示肿瘤易感性、恶变或复发的高风险，另外KRAS突变还用于指导西妥昔单抗及帕尼单抗的治疗。NCCN指南明确推荐所有转移性结直肠癌患者都应进行RAS基因检测（KRAS第2外显子和其他外显子，NRAS），RAS基因突变者不推荐西妥昔单抗及帕尼单抗治疗。

研究显示，KRAS突变者和未突变者使用西妥昔单抗的肿瘤反应率分别为0%和40%，中位PFS分别为10.1周 vs 31.4周，中位OS分别为10.1月 vs 14.3月[45]。KRAS突变与否在帕尼单抗的获益中也有显著区别。在一个比较帕尼单抗和最佳支持治疗用于晚期结直肠癌患者的Ⅲ期临床试验中，KRAS野生型患者在PFS、OS和反应率上均显著优于KRAS突变者。KRAS突变者和未突变者使用帕尼单抗的反应率分别为0%和22%。KRAS野生型患者中，帕尼单抗组vs最佳支持组，中位PFS为12.3周 vs 7.3周，中位OS为6.8 月 vs 1.9月；KRAS突变的患者中，帕尼单抗组vs最佳支持组，中位PFS为7.4周 vs 7.3周，中位OS为4.5月 vs 2月[50]。

KRAS基因检测方法有PCR产物直接测序法、Taqman探针法、单链构象多态性分析法（single strand conformation polymorphism，SSCP）、限制性片段长度多态性方法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、焦磷酸测序方法、变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）和高分辨率熔解曲线分析法（high resolution melting，HRM）等。

4.2 BRAF

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因编码的BRAF蛋白属于RAF家族，参与RAS/RAF/MEK/ERK信号途径，调节细胞增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白是KRAS蛋白的重要效应器之一[51]，因此，BRAF基因发生突变和KRAS突变一样，可使其编码的蛋白激酶处于活性状态而促进细胞异常增殖，导致肿瘤发生[52]。BRAF突变频率为5%～15%，且90%的BRAF突变发生于核苷酸1 799位（腺苷酸取代胸腺嘧啶），最终谷氨酸替代600位的缬氨酸（V600E突变）[53]。

前期的研究提示BRAF基因突变是西妥昔单抗疗效的独立预测因素[54]。该回顾性研究显示，在KRAS野生型的患者中，BRAF突变和未突变者使用帕尼单抗或西妥昔单抗的反应率分别为0%和32%；BRAF野生型患者PFS和OS的获益也显著高于BRAF突变者。基于上述研究，NCCN指南推荐所有转移性结直肠癌患者进行BRAF突变检测，指出V600E突变者不太可能对西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗产生应答。但PRIME试验[55]的回顾性分析和CRYSTAL、OPUS试验的汇总分析[56]均表明BRAF突变对帕尼单抗和西妥昔单抗的疗效无预测作用，仅提示预后不良。

IHC利用特异性抗体VE1识别V600E突变蛋白进行检测，是当前BRAF基因突变常用检测方法[57]。其他可选方法包括Sanger测序、基于多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的检测方法等。

4.3 微卫星不稳定性

微卫星是指人类基因组中的短串联重复序列。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指与正常组织相比，肿瘤组织中的微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。

MSI是由错配修复（mismatch repair，MMR）基因发生缺陷引起的，與肿瘤的发生密切相关。MSI在IV期肠癌中的发生率约为3.5%～5%[58-59]，在散发性结直肠癌中的发生率为10%～15%[60-61]。与无MSI特征的结直肠癌相比，MSI结直肠癌的发生、预后和药物敏感性均不同。指南推荐所有<70岁或者Ⅱ期患者均应考虑进行错配修复蛋白（MMR）检测。具有MSI-H（高度微卫星不稳定）的Ⅱ期患者可能预后较好，而且不能从5-FU的辅助化疗中获益[62]。

MSI检测方法主要有PCR技术和IHC技术。PCR技术主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行检测，MS位点经过荧光标记的PCR扩增后经遗传分析仪毛细管电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断MSI[63]。IHC技术采用IHC检测4种MMR基因的蛋白表达情况来明确是否存在MSI。正常情况下，可以检测到4种蛋白的表达，如结果异常表明至少有一种蛋白没能表达，可能存在相关MMR基因的突变。

5 白血病

白血病是一类源自造血干细胞的恶性克隆性疾病，克隆后的细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，可在骨髓和其他造血组织中恶性增生，使造血受抑制并浸润其他组织。随着白血病融合基因的发现及分子技术的进步，对其进行基因检测在白血病的诊断中意义很大[64]。常见于临床的白血病融合基因有以下几种。

1）BCR-ABL融合基因 通过t（9；22）（q34；q11）形成。其编码的BCR-ABL具有高酪氨酸激酶活性，通过激活下游多条信号通路促使细胞恶化并最终变成白血病。约95%以上的慢性髓细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）患者和20%的急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）患者表达BCR-ABL基因，因此BCR-ABL融合基因可用作慢性粒细胞白血病的分子诊断标志物[65]。

2）PML-RARA融合基因 通过t（15；17）（q22；q22）形成。PML-RARA可干扰RARA在核内的分布和对分化的调控，使大量细胞处于早幼阶段，引起早幼粒细胞白血病（APL）。PML-RARA因此是APL的特异性分子标志[66]。

3）AML1-ETO融合基因 通过t（8；21）（q22；q22）形成。可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变祖细胞更新及成熟过程，也可以产生异常增殖信号，引起白血病发生。AML1-ETO主要发生于M2型白血病，是其重要的分子标志[67]。

4）TEL-AML1融合基因 通过t（12；21）（p13；q22）形成。TEL-AML1可阻碍AML1编码的CBRa进行转录，影响祖细胞的更新和分化。TEL-AML1是儿童前B-ALL最常见的染色体异常之一，阳性预示较好的预后[68]。

5）E2A-PBX1融合基因 通过t（1；19）（q12；p22）形成。E2A在B细胞系ALL中占20%～30%，可作为ALL诊断的分子标志物，辅助预后判断和治疗指导[69]。

6）MLL重排形成的基因 AML中MLL基因经常发生重排形成融合基因，种类较多，如t（11；4）（q23；q21）形成的MLL-AF4。通常情况下，涉及混合血统白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因重排的白血病恶性程度高，对常规化疗不敏感，生存期短是预后不良的标志[70]。

白血病融合基因的检测不仅能作为诊断的依据，同时也是BCR-ABL融合基因等靶点治疗的参考。伊马替尼是FDA批准用于治疗顽固性或复发性Ph+（费城染色体阳性）ALL患者的一线药物。一项临床试验表明，伊马替尼在Ph+ ALL患者中的缓解率超过60%[71]。

目前白血病融合基因的检测主要使用实时定量荧光PCR（RQ-PCR）技术[72]。除FISH、免疫印迹、流式细胞术（FCM）、基因芯片也有不同程度地使用。

6 黑色素瘤

恶性黑色素瘤进展迅速，预后不良，晚期黑色素瘤5年生存率不到6%[73]。近年来，人们逐渐认识到，黑色素瘤的发生发展可能与某些基因的突变有关，且新的靶向药物也相继问世。

6.1 BRAF

BRAF是Raf家族的成员之一，BRAF突变会导致Ras/Raf/Mek/Erk通路异常，最终导致细胞增殖、生长等过程异常。晚期黑色素瘤中有50%会发生BRAF突变[74]，主要突变类型为V600E和V600K，其中V600E占总突变的80%左右，V600E即第15外显子中第1 799位核苷酸胸腺嘧啶（T）突变为腺嘌呤（A），导致蛋白质产物中第600位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）替代[75]。目前FDA批准上市用于BRAF突变的晚期或转移性黑色素瘤的药物有：维罗非尼、达拉非尼胶囊、曲美替尼，有效率分别为53%[76]、59%[77]、69%[78]。

BRAF基因检测方法包括ARMS[76-79]、测序法[80]、HRM[81]、RFLP[82]等。

6.2 NRAS

NRAS是RAS家族的成員之一，黑色素瘤中，NRAS突变率为20%[83]。当NRAS发生突变时，激活CRAF通路。就会促使非正常黑色素细胞增殖。NRAS突变的患者可能对MEK抑制剂敏感。如一项Ⅱ期临床试验显示，NRAS突变黑色素瘤对MEK162（binimetinib）敏感，有效率为20%[84]。

6.3 c-KIT

c-kit原癌基因（c-kit proto-oncogene，c-KIT）活化可激活下游的JAK/STAT/MAPK/PI3K等通路，导致细胞生长失控。黑色素瘤中黏膜和肢端的突变率分别为38%和36%[85]。KIT基因异常可表现为KIT的突变和（或）扩增。以外显子11和外显子13突变最为常见。目前多使用以下四种方法检测c-kit基因突变：①ARMS；②HRM；③杂交探针法；④DHPLC结合直接测序的方法。2013年美国国立综合癌症网建议通过基因检测对合适患者进行靶向治疗。有报道称KIT突变抑制剂伊马替尼对KIT突变的患者有效[54]。

6.4 CTLA-4

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）表达于T细胞表面，当与其配体B-7（CD80/CD86）结合，通过抑制T细胞活化来抑制免疫应答，使肿瘤细胞发生免疫逃逸[86]。2011年美国FDA批准伊匹单抗（ipilimumab）用于手术不可切除或转移性黑色素瘤，其反应率为11%[87]，但对于如何筛选出适合伊匹单抗的优势人群，对预测标志物并未有统一的标准。

6.5 PD-1/PD-L1

目前FDA批准用于不可切除或转移性黑色素瘤的PD-1抑制剂有派姆单抗和纳武单抗，有效率分别为38%[88]、31%[89]。PD-L1抑制剂用于黑色素瘤的治疗尚在研究中。其检测方法同上述肺癌。

7 结语

肿瘤发生的分子机制非常复杂，随着基因组学的深入研究以及基因检测技术不断的发展和完善，越来越多的肿瘤细胞基因结构和相关信号转导通路被发现，以基因检测为基础的精准医疗将从早期预测、个体化诊疗、预后评估等方面使更多的患者受益。

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