ω-3多不饱和脂肪酸对脂多糖诱导的脑损伤新生大鼠的神经保护作用

石计朋，宋亚辉，栗延伟，郭喜霞，李树军，尚 云，桑桂梅，高 俊，郭洪旭， 王卫卫，李珍珍，唐成和，黄丽密

(1.新乡医学院第一附属医院新生儿科，河南 卫辉 453100；2.南阳市第二人民医院超声科，河南 南阳 473000；3.新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003；4.新乡医学院第一附属医院儿童重症监护病房，河南 卫辉 453100；5.温州医科大学附属第一医院新生儿科，浙江 温州 325000)

早产儿脑病是指由于各种原因引起的早产儿脑组织损伤和损伤后出现的神经系统后遗症，如脑性瘫痪、智力发育迟缓、癫痫等[1]。早产儿最严重的脑损伤是脑室旁白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)，其是引起脑性瘫痪的重要病因。PVL引起的脑组织减少可进一步加重脑损伤[2]，缺氧和产前感染是早产儿脑病的主要危险因素。目前，针对早产儿出生后感染所致的早产儿脑损伤的研究较少，且至今尚无阻止感染相关脑损伤的有效治疗方案[3]。脂肪乳是新生儿及早产儿静脉营养支持的重要成分，在新生儿及早产儿生命早期具有重要的价值。以大豆油为基础的脂肪乳剂在早产儿静脉营养中广泛应用，该脂肪乳剂含有丰富的 ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6 polyunsaturated fatty acid，ω-6 PUFA)，其在创伤或感染等严重疾病中可影响粒细胞活性，导致免疫功能受损[4]。ω-3 PUFA亦称ω-3鱼油脂肪乳，是一种在临床中应用时间较短的脂肪乳剂。本课题组前期研究发现，ω-3 PUFA能够通过降低肺损伤大鼠肺部肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平而抑制细胞凋亡，也可以通过下调缺氧缺血新生大鼠肺组织中Toll样受体(Toll like receptor 4，TLR4)、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)、TNF-α、IL-6的表达而降低细胞凋亡率[5-7]。而GRAHAM等[8]研究发现，感染在PVL发病机制中的重要性远大于缺氧。ω-3 PUFA作为一种具有改善免疫功能的脂肪乳，在提供能量的同时，又能调节炎症信号通路，下调炎症因子的表达[9]，对早产儿脑损伤的防治有重要意义。本研究通过对3日龄新生大鼠注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立感染所致脑损伤模型，模拟人类早产儿脑损伤情况，观察 ω-3 PUFA干预后新生大鼠海马组织中TLR4/NF-κB信号通路及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平变化情况，以期为临床治疗早产儿脑损伤、减少神经系统并发症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物48只3日龄Sprague-Dawley大鼠由新乡医学院实验动物中心提供，雌雄不限。所有新生大鼠置于25 ℃、湿度为60%的饲养环境中，昼夜光照时间为12 h/12 h。新生大鼠均由母鼠喂养，注意卫生，及时换水及垫料。母鼠进食饲料与孕期一致，做到营养均衡，满足其生长发育及哺乳需求。

1.2主要试剂与仪器LPS(E.coliO111：B4)购自美国Sigma-Aldrich公司，总RNA提取试剂TRIzol购自上海英骏公司，实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自大连宝生物公司，微量蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，琼脂糖购自上海生工生物工程股份有限公司，TLR4抗体(sc293072)、NF-κB p65抗体(SC-109)购自美国Santa Cruz生物技术公司，ω-3 PUFA购自华瑞制药有限公司，ω-6 PUFA购自四川科伦药业股份有限公司，TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成；RT-PCR仪购自美国ABI公司，PCR仪购自德国Biometra公司，Amersham Imager 600凝胶成像系统购自美国GE仪器有限公司，OLYMPUS显微镜购自奥林巴斯深圳工业有限公司。

1.3实验分组与处理将3日龄新生大鼠随机分为对照组、LPS组、ω-3 PUFA组和ω-6 PUFA组，每组12只；固定时间点测体质量及腹腔注射药物。LPS 组、ω-3 PUFA 组和 ω-6 PUFA 组大鼠腹腔注射0.6 mg·kg-1LPS制备脑损伤模型，对照组大鼠腹腔注射等容积生理盐水；然后4组大鼠分别立即腹腔注射等体积的生理盐水、生理盐水、ω-3 PUFA 和 ω-6 PUFA[10]，24 h后各组大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，快速断头处死，取出脑组织，留取海马组织，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4实时荧光定量PCR检测大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达将保存的大鼠海马组织置于放有液氮的研钵中充分研磨，加入适量总RNA抽提试剂TRIzol，获取脑组织总RNA。TLR4上游引物序列为5′-ACAGGGCACAAGGAAGTAGC-3′，下游引物序列为5′-GTTCTCACTGGGCCTTAGCC-3′；NF-κB上游引物序列为5′-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3′，下游引物序列为5′-TTTCTTCAATCCGGTGGCGA-3′；IL-1β上游引物序列为5′-GCAACTGTCCCTGAACTCAACT-3′，下游引物序列为5′-TTGTCGAGATGCTGCTGTGA-3′；IL-6上游引物序列为5′-AACGATGATGCACTTGCAGA-3′，下游引物序列为5′-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3′；GAPDH上游引物序列为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书由RNA合成为cDNA，将cDNA加入20 μL SYBR的反应体系中采取两步法PCR检测，每份样品重复 3 次。

1.5Westernblot法检测大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表达取保存的大鼠海马组织，加入适量细胞组织快速裂解液，研磨充分后放于冰上裂解1～3 h，4 ℃下 12 000×g离心10 min，采用微量蛋白质定量试剂盒检测海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达，操作严格按照试剂盒说明书进行；凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移至二氟乙烯膜，脱脂牛奶室温封闭2 h，分别滴加TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6抗体，4 ℃下孵育过夜，二抗室温孵育 l h，超敏增强化学发光法显影，应用Image J 软件对结果进行分析。

2 结果

2.14组新生大鼠的一般情况LPS组、ω-3 PUFA组和ω-6 PUFA组新生大鼠腹腔内注射LPS后出现皮肤暗红，饮食和精神稍差，但活动减少不明显。对照组新生大鼠皮肤颜色、饮食和精神均无异常。

2.24组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA表达的比较结果见表1。4组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LPS组、ω-3 PUFA组、ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA表达均高于对照组(P<0.05)；ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和 IL-6 mRNA表达高于LPS组(P<0.05)；ω-3 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA表达均低于LPS组和ω-6 PUFA组(P<0.05)。

表14组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA表达比较

组别nTLR4mRNANF-κBmRNATNF-αmRNAIL-1βmRNAIL-6mRNA对照组123.14±1.053.26±0.825.25±1.082.33±0.071.15±0.43LPS组1215.76±1.59a7.13±1.10a9.71±2.14a7.83±0.85a4.78±0.51aω-6PUFA组1218.83±2.10ab8.79±2.08ab11.95±3.23ab10.97±2.24ab6.37±1.17abω-3PUFA组1210.63±0.07abc5.86±1.05abc7.65±2.29abc5.23±1.31abc3.36±0.72abcF5.7525.6633.1936.088.463P0.0020.0020.0110.0010.000

注：与对照组比较aP<0.05；与LPS组比较bP<0.05；与ω-6 PUFA组比较cP<0.05。

2.34组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达比较结果见表2和图1。4组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LPS组、ω-3 PUFA组、ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达均高于对照组(P<0.05)；ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达均高于LPS组(P<0.05)；ω-3 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达均低于LPS组和ω-6 PUFA组(P<0.05)。

表24组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平比较

组别nTLR4NF-κBTNF-αIL-1βIL-6对照组121.17±0.021.12±0.031.25±0.081.33±0.071.15±0.03LPS组121.73±0.15a1.87±0.10a1.79±0.14a1.83±0.15a1.58±0.11aω-6PUFA组121.96±0.17ab2.21±0.12ab1.95±0.23ab1.97±0.24ab1.77±0.17abω-3PUFA组121.57±0.11abc1.58±0.09abc1.55±0.09abc1.63±0.31abc1.36±0.12abcF5.9136.2744.12013.2128.773P0.0020.0010.0110.0000.000

注：与对照组比较aP<0.05；与LPS组比较bP<0.05；与ω-6 PUFA组比较cP<0.05。

1：对照组；2：ω-3 PUFA组；3：ω-6 PUFA组；4：LPS组。

图14组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表达(Westernblot)

Fig.1ExpressionofTLR4，NF-κB，TNF-α，IL-1βandIL-6proteininhippocampaltissuesofneonatalratsinthefourgroups(Westernblot)

3 讨论

早产儿出生后罹患感染或炎症性疾病均可能损害尚未发育成熟的大脑，增加神经系统后遗症的风险[11]。早产儿感染后，全身性的细菌感染造成了脑部炎症，导致脑损伤。病原体和其产生的大量内毒素既可以直接损伤脑组织，又可刺激体内具有神经毒性的细胞因子如TNF-α、IL-6等大量分泌[12]，导致血脑屏障的通透性增加、小胶质细胞活化及凋亡通路异常激活，对早产儿发育中的大脑白质、灰质及小脑造成损害[13]。炎症时脑脊液中促炎因子水平升高，大脑受损部位的小胶质细胞活化，引起一系列脑损伤如脑室扩大、PVL、脑积水等[14]。

TLR是一种模式识别受体，在炎症反应进程中发挥重大作用；TLR4可使下游的NF-κB活化，NF-κB活化后转移至细胞核内，进而诱发各种促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等释放[15-17]。TNF-α是具有诱导细胞增殖和凋亡功能的多效能细胞因子，中枢神经系统中的TNF-α主要来源于活化的小胶质细胞和星形细胞，可直接产生毒性作用。IL-6是一种多功能促炎因子，可以诱导机体炎症急性期反应[18]。IL-1β可调节细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达，而ICAM-1可促进中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞在损伤区域聚集，这些细胞释放细胞毒性物质，进一步加重神经损伤。另外，IL-1β延迟表达可抑制少突胶质细胞前体增殖，从而阻止脑白质修复[19]。有研究发现，在出生后 5 d 的小鼠脑内注射IL-1β可导致小鼠脑室扩大，成熟少突胶质细胞和神经元死亡、髓鞘化和轴突受损；新生小鼠经外周血注射IL-1β后，血清中TNF-α水平明显升高，行为测试报告提示长期记忆有损害，可作为出生后全身炎症反应参与早产儿脑损伤的证据[20]。

出生后3～7 d啮齿类动物与23～36周人类胎儿中枢神经系统的发育水平接近。动物实验表明，小鼠全身性LPS刺激可以导致脑损伤，在人类早产儿中也有类似的脑损伤出现[21-22]。给予2日龄和7日龄新生大鼠腹腔注射 0.3、0.6、0.9 mg·kg-1LPS 均可制备感染所致脑损伤模型，而且研究发现，腹腔注射 0.6 mg·kg-1LPS既能减少模型大鼠死亡率，又能导致明显的脑损伤[23]。本课题组预实验发现，应用 0.6 mg·kg-1LPS 腹腔注射1 d后也出现了类似的结果，故本研究选择3日龄新生大鼠制备脑损伤模型。

研究证实，ω-3 PUFA可对缺氧缺血新生大鼠的大脑起保护作用[24]。但国内外有关ω-3 PUFA对感染所致脑损伤影响的研究很少，其作用机制尚未明确。有研究发现，早产儿脑损伤患者血清TLR4和TNF-α水平升高[25]。本研究发现，与对照组比较，应用LPS造模成功的新生大鼠脑组织中TLR4、NF-κB表达明显增强，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平也相应升高。本研究结果显示，ω-6 PUFA能够上调感染大鼠脑组织中TLR4、NF-κB表达，增加炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，有加重脑损伤的可能性；而ω-3 PUFA能够拮抗LPS的致炎作用，下调TLR4、NF-κB表达，减少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，故推测ω-3 PUFA有改善LPS所致新生大鼠脑损伤的作用。

综上所述，ω-3 PUFA能下调大鼠海马组织中TLR4/NF-κB信号通路，减少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放，对LPS所致的脑损伤新生大鼠有神经保护作用，但是其调节免疫功能的具体机制尚不明确，仍需更多的基础实验来证实。

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