铅离子诱导PS2.M构象改变特性及其氡非标记比色传感检测新方法

2018-05-30 11:33刘红文季颖宋春丽田刚李诗雅杨桂英吕昌银
分析化学 2018年5期

刘红文 季颖 宋春丽 田刚 李诗雅 杨桂英 吕昌银

摘 要 以氡辐射衰变最终形成稳定的子体铅作为目标检测物,建立了检测氡累积浓度的核酸适配体生物分析新方法。K+诱导富G单链核苷酸PS2.M形成反平行G-四链体四链体,辅因子血红素与G-四联链体结合,形成具有过氧化物酶活性的稳定复合物,催化TMB-H2O2体系发生显色反应。同时加入Pb2+时,Pb2+诱导PS2.M形成结构更加稳定的“缺口”型反平行G-四链体,K+和血红素游离在溶液之中,体系吸光度响应值急剧降低。基于此构建了一种基于Pb2+诱导PS2.M构象改变的过氧化物酶活性“Turn-off”型比色传感器。在5.0×109~1.8×107 mol/L范围内,吸光度降低值ΔA与Pb2+浓度呈线性关系,线性回归方程为ΔA=0.36+0.13C, R=0.9987。本方法对Pb2+的检出限为3.76 nmol/L (S/N=3),氡的检出限为1.96×103 Bq·h/m3 (S/N=3)。本方法灵敏、准确,样品溶液可直接检测,操作简单,避免了现场进行氡辐射剂量测量的放射性危害,为环境中氡的检测提供了新方法。

关键词 氡;子体铅;核酸适配体;G-四链体;构象转变;比色传感

1 引 言

氡是天然放射系中唯一无色、无嗅、无味的气体放射性元素,半衰期为3.82天,是室内放射性气体污染物的主要存在形式[1,2]。经过一系列短寿命子体链的衰变,氡产生的稳定子体210Pb半衰期长达21年[3]。室内氡照射和吸烟具有协同效应,是导致肺癌的第二大杀手[4,5]。世界卫生组织与国际癌症研究机构已将氡列为19种致癌物质之一[6]。研究表明,21世纪以来我国室内平均氡浓度较20世纪80年代和90年代分别上升了57%和42%[7],室内氡污染的危害受到越来越多的关注。因此,科学有效地采集和检测室内中的氡浓度,建立经济、有效、简便/快捷的检测氡的累积辐射剂量的方法具有重要的卫生学意义[8]。

近年来,核酸适配体(Aptamer)已经广泛应用于生命科学、临床诊断、药物筛选和环境科学等领域[9~11]。在重金属离子的检测中,核酸适配体得到了充分应用,Liu[12]和Jiang[13] 等利用Hg2+可以形成T-Hg-T结构,实现对Hg2+的高特异性和高灵敏度的检测。Lu等[14]通过Pb2+能诱导富G核酸链-TBAA特异性形成G-四链体结构,从而实现Pb2+的高特异性和高灵敏度的可视化检测。邓欢等[15]将门控制效应和核酸适配体结合,构建检测Pb2+的电化学生物传感器。Long[16]与Deng[17] 等基于Pb2+诱导核酸适配体PW17和T30695构型改变导致体系荧光强度变化,开展了氡的非标记荧光传感生物分析新方法研究。

G-四鏈体构象的稳定性与其所结合的阳离子种类有关,不同构型G-四链体与Hemin结合后催化活性差异明显,表现出不同的过氧化物酶活性[18~20]。Kong研究组基于G-四链体与Hemin结合具有过氧化物酶活性,催化ABTS-H2O2系统显色,构建了Ag+、Hg2+等重金属的检测平台[21~23]。本研究根据氡辐射衰变特点,结合Pb2+的现代分析技术,研究了K+和Pb2+诱导PS2.M分别形成不同结构G-四链体的特性,建立了一种基于Pb2+诱导PS2.M构象改变的过氧化物酶活性“Turn-off”型比色传感器,实现了Pb2+和氡的灵敏检测。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器公司); J-815圆二色谱光谱仪(日本Jasco公司); AB204-S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司); PB-20(PB-S)型精度酸度计(德国赛多利斯公司); 氡室(南华大学核工业第六研究所); 混合纤维素膜(Merck Milipore公司)。

冰醋酸(HAc,天津市福晨化学试剂厂); 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、KCl(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 铅标准溶液(100.0 μg/mL,中国计量科学院); 富含鸟嘌呤的寡核苷酸链PS2.M(5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3',上海生工生物工程股份有限公司合成); 氯化血红素(Hemin)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB, 上海西格玛奥德里奇贸易有限公司); HCl、H2O2(广东光华科技股份有公司); 实验用水均为灭菌超纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm)。

2.2 氡样本的采样方法[16]

以10 mL 0.2%(V/V)冰醋酸作为吸收液,以直径70 mm、高17 mm一次性塑料培养皿为收集器,在平皿口加封混合纤维素膜(孔径为0.8 μm,Milipore公司); 设定采样时间,将采样器放入氡室,被动式采集含铅样本。采样后密封状态、室温放置4天,经过氡的半衰期,用0.2%醋酸定容至10 mL,混匀,4℃保存,待测。

2.3 Pb2+标准溶液的紫外可见光谱测定[19]

在反应管中,依次加入一定浓度的Pb2+标准溶液、50 μL 100 mmol/L Tris-HAC缓冲液(pH=5.0)、10 μL 10 μmol/L K+标准溶液、 20 μL 25 μmol/L Hemin试剂和50 μL 1 μmol/L PS2.M溶液,充分混匀后,在室温下反应20 min。然后加入30 μL 5 mmol/L TMB及20 μL 100 mmol/L H2O2,混匀,室温下放置35 min后,加入50 μL终止液(2 mol/L HCl),用超纯水定容至500 μL,混匀,用UV-2550紫外-可见分光光度计测定。

3 结果与讨论

3.1 比色传感原理

根据氡最终衰变成为子体铅,210Pb的半衰期达21年的特点,本研究以子体铅作为目标检测物,研究建立氡浓度的核酸适配体生物分析新方法。氡是一种气态放射物质,密度9.73 g/m3,易溶于水,本研究选择稀醋酸作为吸收液,并用微孔混和纤维素膜覆盖采样器进气口,排除了空气干扰物,氡衰变后的子体铅与稀醋酸发生化学反应,生成Pb2+。

如图1所示,未加入Pb2+时,K+诱导PS2.M形成反式平行G-四链体,该四链体与辅因子血红素(Hemin)结合,形成稳定的具有过氧化物酶活性的复合物,催化TMB-H2O2系统氧化显色。当体系中同时引入Pb2+和K+时,这两种离子竞争与PS2.M的反应,但由于Pb2+与之作用能力更强,诱导PS2.M发生构象改变,形成结构更加稳定的G-四链体,抑制了K+的诱导能力,使辅因子血红素游离在溶液之中,抑制了TMB-H2O2體系氧化还原反应的进行,体系吸光度急剧降低。椐此,建立基于Pb2+诱导的PS2.M构象改变的比色法检测Pb2+和氡[19]。

3.2 紫外-可见光吸收光谱和圆二色谱表征

由图2可见,单独TMB+H2O2体系不发生显色反应 (曲线c); 曲线a在451 nm处有最大吸收峰,说明K+诱导 PS2.M形成的G-四链体结合血红素的复合物具有类过氧化物酶活性,对TMB-H2O2氧化还原反应具有明显的催化作用; 曲线b在451 nm处吸光度明显降低,其原因是Pb2+将K+从已经形成的反式平行G-四链体中竞争出去,使PS2.M构象发生改变,辅因子血红素游离在溶液之中,抑制了TMB-H2O2体系的氧化还原反应,体系吸光度响应值急剧降低。

圆二色谱测定结果如图3所示,体系溶液中只有PS2.M时,在260 nm处出现一个正峰,加入K+后,在295 nm处出现一个正峰,符合K+诱导PS2.M形成反平行G-四链体结构的特征[24]。在PS2.M中加入Pb2+后,在265 nm处有一个负峰,312 nm处出现一个正峰,这是被Pb2+诱导形成反平行G-四链体的峰的典型谱特征[24~26]。当向PS2.M溶液中同时加入K+和Pb2+时,295 nm处的正峰消失,只在312 nm处出现正峰,且“PS2.M+ K++Pb2+”体系和“PS2.M+Pb2+”体系的圆二色谱图形非常接近,说明K+和Pb2+竞争与PS2.M反应,Pb2+的存在,抑制了K+诱导PS2.M构象改变的能力,也说明了Pb2+与PS2.M结合形成的G-四链体结构更稳定、更容易形成[24]。

3.3 实验条件优化

改变Tris-HAc缓冲液的pH值,考察pH值对反应体系的影响。结果表明,pH值对体系吸光度变化值(ΔA)影响较大。pH=4.0~5.0时,随pH值增大,ΔA值逐渐上升; pH=5.0~7.5时,随pH值增大,ΔA值逐渐下降,因此选择pH=5.0的Tris-HAc溶液维持体系的酸碱性。在pH=5.0条件下进行Tris-HAc缓冲液用量的优化,结果表明,当Tris-HAc缓冲液终浓度为10 mmol/L时体系吸光度值变化最显著。

TMB作为一种显色剂,其用量对体系吸收值有一定影响。实验结果表明,用量为0.3 mmol/L时体系吸光度值变化显著且反应稳定。Hemin作为辅助因子,用量为1 μmol/L时,体系吸光度值变化最显著。

Pb2+与K+竞争诱导PS2.M发生构象改变需要一定的反应时间。实验表明,加入PS2.M20 min后,ΔA值逐渐增大; 当时间超过20 min后,ΔA值变化比较平缓,故选择20 min作为PS2.M最佳孵育时间。考察了TMB与H2O2显色时间对实验的影响,最终选择在反应40 min后加入HCl终止反应。

3.4 共存干扰物的影响

如图4所示,10倍浓度的Bi3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、NH+4以及Cr3+和 Hg2+对160 nmol/L Pb2+测定的干扰很小。由于本方法通过采集氡的子体铅进行氡的检测,采样时,在采样器进气口加封0.8 μm的混和纤维素微孔膜,保证气体氡可以辐射进入采样容器,以利于采集子体铅,阻止了空气中其它颗粒干扰物进入采样容器。因此,这些干扰物质在样品采集时大部分已被排除在容器外,其可能产生的影响被进一步降低,不干扰测定。

3.5 标准曲线与检出限

测定Pb2+系列标准溶液的吸光度值A及未加Pb2+的试剂空白溶液的吸光度值A0。计算各反应的ΔA(=A0-A)值,绘制标准曲线。如图5所示,体系的吸光度差值ΔA与Pb2+浓度在0.5×108~1.8×107 mol/L范围内呈良好的线性关系,回归方程为ΔA=0.36+0.13CPb(108 mol/L),相关系数R=0.9987。对空白溶液平行测定11次,计算空白溶液的标准偏差为sb=0.165,按照CL=3sb/k计算出Pb2+的检出限为3.76 nmol/L。

3.6 氡累积浓度的测定和模型建立

按照采样方法,在南华大学核六所氡实验室采集累积浓度分别为0.71、1.45、3.54、6.57、10.17、13.78、17.60、21.70和25.25(104 Bq·h/m3)的氡辐射样品溶液,采用本方法进行测定,结果如表1。ΔA值随着氡累积浓度的增加而增大,根据Pb2+的标准曲线回归方程ΔA=0.36+0.13CPb(108 mol/L),可得知样品中Pb2+含量也逐渐增加。由图6可见,在一定范围内,氡浓度与ΔA值呈现良好的线性关系:ΔA=0.089CRn+0.59, R=0.9906。由此可建立氡的累积浓度与子体铅之间的定量测定模型。本方法对氡的检测范围为7.10×103~1.02×105 Bq·h/m3, 检出限为1.96×103 Bq·h/m3 (3σ)。

3.7 样品分析与方法学比较

我国GB/T18883-2002《室内空气质量标准》规定,室内空气应无毒、无害、无异常嗅味,其中放射性参数氡(222Rn)年平均值 400 Bq/m3(标准值),达到此水平建议采取干预行动以降低室内氡浓度。径迹蚀刻法是中国国家标准方法,对氡累积浓度的检出限为2.1×103 Bq·h/m3[27],本方法对氡累积浓度的检出限为1.96×103 Bq·h/m3(< 2.1×103 Bq·h/m3),检出限更低。

按照采样方法,采集了2个氡样本,用本方法与美国RAD7测氡仪进行对比测定。结果如表2,对两种方法t检验结果表明,在可信区间为95%的范围内,计算出t1=1.35,t2=0.59,均小于理论值t0.05(10)=2.228, 按照α=0.05的水平接受H0,即差异没有统计学意义,可认为两种方法测定结果的总体均数相同,证明本方法测定的结果可靠。

4 结 论

以氡辐射衰變最终形成稳定的子体铅作为目标检测物,建立了检测氡累积浓度的核酸适配体生物分析新方法。本方法仪器设备简单、操作简单快速、抗干扰能力强、灵敏度高,Pb2+的检出限为3.76 nmol/L,氡的检出限为1.96×103 Bq·h/m3。在核科学和物理学中,一般针对氡辐射产生的α射线测定氡的累积浓度。本方法避免了现场进行氡辐射剂量测量的放射性危害,具有良好的应用潜能。

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