4种动物骨骼氨基酸组成及其营养价值评价

帕尔哈提·柔孜，帕丽达·买买提，高彦华，阿衣吐逊·阿布都外力，艾合米丁·外力，阿布力米提·伊力，*，阿吉艾克拜尔·艾萨

（1.中国科学院新疆理化技术研究所，新疆特有药用资源利用重点实验室，新疆乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学护理学院，新疆乌鲁木齐830011；3.中国科学院大学，北京100049）

我国是肉类生产和消费大国，副产物畜禽骨骼的质量约占动物体质量的20%～30%，资源极为丰富，动物骨质和骨髓在中药民族药中具有悠久的应用历史，但综合利用水平不高，资源浪费及环境污染现象仍然严重[1-5]。动物药活性成分主要有蛋白质、多肽、氨基酸类及其他小分子物质[6]。畜禽骨骼也富含蛋白质、脂肪、骨胶原、软骨素（酸性黏多糖）等营养成分、以及多种矿物质，且含量是鲜肉的数倍，其中蛋白质含量较高，而脂肪含量则相对较低，属于一种典型的高营养低热能食品[7]。因前期对其化学成分和药理作用未深入研究，骨骼利用在国内尚未能得到全面推广，常被浪费或加工成附加值很低的产品。

畜禽骨骼骨髓是一种高营养的传统药食兼用食物，在民间被认为具有强筋壮骨，延年益寿，滋补等作用，这可能与其中的优质蛋白，矿物质和脂肪等活性成分起效有关[8-9]。目前，骨类产品开发利用主要集中在猪骨中提取胶原蛋白和骨素[10-11]，分析骨汤中呈味氨基酸[12]和钙等矿物质含量[13]及其相关疾病治疗[14]等方面，对其它骨资源研究未能得到充分关注，针对骨髓营养化学成分研究更为鲜见。早已研究证明畜禽骨营养成分高于肉类的观念[15]，但长期以来消费者重肉轻骨的不良习俗，加之骨类产品加工利用时使用全骨（一般未分开骨质和骨髓部分）等因素，造成了骨有效资源的丢失。因此，了解骨骼蛋白质多种营养成分，能否利用其能满足老年人，高体能消耗的运动员，尤其是生长期儿童对钙，锌，铁等营养需求开发保健食品等研究工作具有现实意义。为了进一步确定骨骼营养价值，本文将新疆特色4种动物骨骼中骨质和骨髓分开，制备骨髓粉末、骨髓蛋白、骨质蛋白，从蛋白质、氨基酸种类、组成特点等方面进行分析检测，并进行营养学评价，旨在为深入研究副产物-骨骼资源的营养和药用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4种动物腿骨，分别来自于多浪羊Duolang Sheep（伽师县，新疆）、新疆褐牛Xinjiang Brown Cattle（塔城地区，新疆）、伊犁马 Yili Horse（昭苏县，新疆）、新疆双峰骆驼 Xinjiang Bactrian Camel（乌苏市，新疆），经鉴定，凭证标本存放于新疆理化技术研究所生物大分子化合物实验室。正己烷、氢氧化钠：天津市百世化工有限公司；硫酸铜：天津市大茂化学试剂厂；浓硫酸、硫酸钾、硼酸、盐酸（均为国产分析纯）：烟台市双双化工有限公司；天门冬氨酸、精氨酸、谷氨酸等18种氨基酸标准品：美国Sigma公司。

L-8900日立全自动氨基酸分析仪：日本日立公司；DF-10IS集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城工贸有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；165－8001型小型电泳仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；RE252A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。ME204电子天平：梅特丽－托利多仪器上海有限公司；FDU－2100型冷冻干燥仪：北京泰亚赛福科技发展有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

4种动物腿骨骼样品先存于－4℃冰箱数小时，使骨髓硬化成块，便于富集。骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，清洗3次～5次去除血瘀和杂物之后收集骨髓。骨质用蒸馏水浸泡数次，用刀具以除去肉块、骨腔内血瘀和残留骨髓，待用。

1.2.2 骨髓粉末（bone marrow powder，BMPD）的制备

取骨髓原料，用刀具切成小块，小块骨髓置捣药罐加 1∶6（g/mL）液氮冷冻粉碎，次数为2 次～4次，充分粉碎成细粉末后保存与－4℃，即得到骨髓粉末。

1.2.3 骨髓蛋白（bone marrow protein ，BMP）的提取

称取骨髓粉末 100 g，料水比 1 ∶5（g/mL），温度45℃，提取4 h，提取次数3次～5次。每次提取后用分液漏斗分离油水（提取物）层，油层再加蒸馏水提取，合并滤液，加正己烷脱脂，适当浓缩后冷冻干燥，得到骨髓蛋白粉。

1.2.4 骨质蛋白（bone protein，BP）的提取

称取骨质（去除骨髓）1 000 g，分成小块，用高压锅水蒸煮提取，料水比 1 ∶7（g/mL），共提取 4次（6、4、2、2 h）。每次提取后去除油层，再加同量蒸馏水反复提取至颜色变清。合并滤液，加正己烷脱脂，适当浓缩后冷冻干燥，得到骨质蛋白粉。

1.2.5 蛋白含量测定

利用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定，取样品2 mg～4 mg，加1 mL水溶解，根据BCA蛋白测量试剂盒说明书，用酶标仪于562 nm处测定吸光度。

1.2.6 电泳分析

参照文献[16－17]并做了些修改：十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）浓缩胶质量分数为8%，分离胶质量分数为12%，胶厚1.0 mm。称取骨髓和骨质蛋白样品10 mg，加1 mL水溶解，离心，取上清液。蛋白样品按V（4×蛋白质上样缓冲溶液）∶V（蛋白质样品）=1∶4（体积比），在沸水中煮沸 5min，取10 μL上样。初始电压为75 V电泳，分离0.5 h后电压调到150 V。电泳完毕后，固定（1 h～2 h）,用考马斯亮蓝染色 G－250进行染色（1.5 h～2 h）、脱色（反复更换脱色液直到背景清晰），拍照。

1.2.7 氨基酸测定方法

按照GB5009.124－2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》方法测定。

1.2.8 分析方法

必需氨基酸－E（异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，色氨酸－未检测到）；非必需氨基酸－N（胱氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸）；药用氨基酸－D（天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙、氨酸、赖氨酸、精氨酸）；儿童氨基酸（精氨酸、组氨酸）；鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）；甜味氨基酸（甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸）；苦味氨基酸（苯丙氨酸、结氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸）；芳香类氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）；支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）；非极性氨基酸（结氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、脯氨酸、丙氨酸）；不带电荷极性氨基酸（甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胖氨酸、酪氨酸）；带正电荷氨基酸（组氨酸、赖氨酸、精氨酸）；带负电荷的极性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）；采用1973年联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）修订的人体必需氨基酸评分标准模式进行营养价值评定[18]，氨基酸评分（amino acid score，AAS）和化学评分（chemical sore，CS）由以下公式计算[19]：

氨基酸评分（AAS）=样品中某种氨基酸含量（mg/g，蛋白质）/FAO/WHO模式谱中同种氨基酸含量（mg/g，蛋白质）

化学评分（CS）=样品中某种氨基酸含量（mg/g，蛋白质）/全鸡蛋模式谱中同种氨基酸含量（mg/g，蛋白质）

2 结果与分析

2.1 4种骨髓和骨质蛋白含量分析

4种骨髓蛋白和骨质蛋白含量比较见表1。

表1 4种骨髓和骨质蛋白含量比较Table 1 Comparison of the protein contents in four types of BMP and BP %

由表1可知，4种骨髓蛋白含量均高于骨质蛋白，其中羊骨髓蛋白含量最高，其次是马骨髓蛋白，BCA法主要是测定水溶性蛋白为主，故骨髓粉末不易进行测定。

2.2 4种骨髓和骨质蛋白电泳图谱分析

4种动物骨髓和骨质蛋白电泳图谱见图1。

图1 4种动物骨髓和骨质蛋白电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE analysis for four types of animals BMP and BP

由图1可知，图A中4种骨髓蛋白谱带均显示在66 kDa处和9.5 kDa～14.4 kDa处，其中马骨髓蛋白在9.5 kDa～14.4 kDa处谱带印迹较明显，其次是牛骨髓蛋白。骆驼骨髓蛋白普带在6.5 kDa上下处出现，但印迹不清晰。图B中4种骨质蛋白电泳普带不清晰，不整齐，甚至未显示，这可能是高温蒸煮破坏蛋白空间结构和肽键，导致谱带均混和在一起，图谱不清晰，蛋白变形[20]。骨髓粉末含油量90%～95%之间，不易进行电泳分析。综上，4种骨髓蛋白谱带与牛血清白蛋白（分子量为66 000 Da）谱带相近，其余的多肽部分需进一步分离纯化鉴定。

2.3 骨髓粉末与蛋白水解氨基酸含量分析

4种骨髓粉末及其蛋白氨基酸组成与含量见表2。

由表2可知，4种骨髓蛋白中均含有17种氨基酸，骨髓粉末和蛋白氨基酸总量变幅分别为0.58 mg/g～37.64 mg/g，275.48 mg/g～495.06 mg/g；E/N 变幅范围分别 为0.28 mg/g～0.46 mg/g，0.49 mg/g～0.57 mg/g，与FAO/WHO提出的理想蛋白质标准要求E/N（0.6）较为接近的是马和羊骨髓蛋白，骨髓粉末E/N比例均小于标准模式。E/T变幅范围分别为0.22 mg/g～0.32 mg/g，0.33 mg/g～0.36 mg/g，与FAO/WHO提出的理想蛋白质标准要求E/T（0.4）较为接近的是马骨髓蛋白。品种间氨基酸总量高低依次为马骨髓蛋白＞牛骨髓蛋白＞羊骨髓蛋白＞骆驼骨髓蛋白＞羊骨髓粉末＞马骨髓粉末＞牛骨髓粉末＞骆驼骨髓粉末；必需和药用氨基酸含量高低与氨基酸总量顺序一致。骨髓粉末中甘氨酸，谷氨酸含量较高；骨髓蛋白中谷氨酸，亮氨酸含量较高，谷氨酸在体内与血氨形成谷氨酰胺，清除有毒化合物，调节神经衰落，为脑细胞提供营养[21]。总之，骨髓蛋白氨基酸种类齐全，具有较高的营养价值，含量高于骨髓粉末，其中马骨髓蛋白氨基酸组成比例较接近于FAO/WHO模式。

表2 4种骨髓粉末及其蛋白氨基酸组成与含量Table 2 The composition and contents of amino acids in four types of BMPD，BMP mg/g

2.4 骨质蛋白水解氨基酸含量分析

4种骨质蛋白水解氨基酸组成与含量比较见表3。

表3 4种骨质蛋白水解氨基酸组成与含量Table 3 The composition and contents of amino acids in four types of BP mg/g

续表3 4种骨质蛋白水解氨基酸组成与含量Continue table 3 The composition and contents of amino acids in four types of BP mg/g

由表3可知，4种骨质蛋白中17种氨基酸含量差异较大，氨基酸总量变幅为144.75 mg/g～820.97 mg/g，E/N与 E/T变幅范围分别为0.23 mg/g～0.32 mg/g，0.19 mg/g～0.24 mg/g，含量均低于FAO/WHO模式提出的标准要求。品种间氨基酸总量高低依次为马骨质蛋白＞羊骨质蛋白＞牛骨质蛋白＞骆驼骨质蛋白；必需和药用氨基酸含量高低与氨基酸总量顺序一致。骨质蛋白中甘氨酸，谷氨酸，脯氨酸，丙氨酸，精氨酸含量较高，甘氨酸对调节胆固醇浓度，防止高血压，治疗糖尿病，预防呼吸道疾病有良好效果[21]。其中马骨质蛋白必须和药用氨基酸占比上处于优势位置，具有很好的营养和食疗药用价值。总之，骨质蛋白氨基酸含量较为丰富，且含量均高于骨髓蛋白和粉末，但氨基酸组成比例均小于FAO/WHO 标准模式。

2.5 4种骨髓和骨质蛋白氨基酸营养评价

4种骨髓和骨质蛋白水解氨基酸组成的评价见表4。

表4 4种骨髓和骨质蛋白水解氨基酸组成的评价Table 4 Evaluation of essential amino acids composition in four types of BMP and BP mg/g

续表4 4种骨髓和骨质蛋白水解氨基酸组成的评价Continue table 4 Evaluation of essential amino acids composition in four types of BMP and BP mg/g

从表4可知，马骨质蛋白与牛骨髓蛋白CS及AAS值较高，一般AAS与CS的数值越接近1，说明该种蛋白与FAO/WHO模式和全鸡蛋蛋白模式中的推荐值越接近，若大于或小于1，则出现相对过剩或不足[22]。组分中马骨质蛋白赖氨酸（0.79 mg/g），缬氨酸（0.66 mg/g）较接近于标准氨基酸模式谱要求，其它样品含量相对较低。赖氨酸能促进钙的吸收，有利于形成胶原和结缔组织、缓解疲劳，说明这些氨基酸营养条件某种程度上也能满足人体需要。骨髓粉末氨基酸含量较低，有些氨基酸未检测出，为了客观评价骨骼中氨基酸组成比例，本表主要以骨髓和骨质蛋白氨基酸为主。两种不同模式分析中，马骨髓及其骨质蛋白评价指标比较高，这进一步表明其具有较高的营养价值。除了骆驼骨髓蛋白之外，其它骨髓蛋白在FAO/WHO 模式条件下第二限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，而骨质蛋白限制性氨基酸的组成与骨髓相反。总之，某一种动物骨髓和骨质蛋白的限制性氨基酸是特定的，随着动物年龄大小和品种不同等因素，氨基酸含量上存在很大差异，可根据蛋白质互补法，与其他可食动植物蛋白结合开发保健食品，能促使资源有效利用并提高营养价值。

2.6 4种骨髓和骨质蛋白各类氨基酸组成比较

4种骨髓和骨质蛋白各类水解氨基酸含量比较见表5。

表5 4种骨髓和骨质蛋白各类水解氨基酸含量比较Table 5 Comparison of all kinds amino acids content in four types BMP and BP mg/g

由表5可知，呈味氨基酸可分成鲜、甜和苦味3类，4种骨质和骨髓蛋白甜味类氨基酸含量均高于鲜味类（大于1.5倍～2倍左右），骨髓蛋白苦味类含量均高于甜味，骨质蛋白恰恰相反。猪骨汤中甜味类含量高于苦味[12]，这与骨质蛋白结果一致，表明本文氨基酸种类分组比较可靠。骨的利用方式常以熬汤食用为主，呈味氨基酸的含量对骨汤的口感起着至关重要的作用，因为熬汤时加骨骼一起煮使其中的优质蛋白质、功能肽、呈味多肽和游离氨基酸等营养成分释放出来，使得骨汤的味道鲜美，易于消化吸收。骨髓蛋白中牛和羊骨髓蛋白甜味氨基酸含量较高，骨质蛋白中马和羊骨含量较高，但马骨苦味氨基酸含量相当较高。甜味类氨基酸给予骨汤甘甜爽口的特性，还能减少苦味，有效增强食物的口感，为羊骨，牛骨常做成骨汤食用提供了解释。

骨髓蛋白芳香族氨基酸在牛和羊骨髓蛋白中含量较高，而其在骨质蛋白中，马和羊骨质蛋白含量较高，芳香族氨基酸不仅影响着食物的香美程度，还与支链氨基酸构成支/芳比值，具有临床疗效。支链氨基酸能够促进肌肉增长、胰岛素和生长激素释放，提高运动耐力，延长寿命，在肝病治疗中，富含支链搭配和低芳香氨基酸的制剂具有临床意义[22]。骨髓和骨质蛋白支/芳比值排在前四位的依次是羊骨质蛋白，马骨质蛋白，马骨髓蛋白，羊骨髓蛋白，这对今后开发其新的药用功效具有指导作用。

在极性带电与否氨基酸分析中，极性氨基酸总量大于非极性，牛和骆驼骨髓蛋白所含带正电荷氨基酸数量高于相应骨质蛋白，其中含量排名前四位的依次是马骨质蛋白，羊骨质蛋白，羊骨髓蛋白，牛骨髓蛋白；许多阳离子抗菌肽不仅具有高效的杀菌作用，还具有抗癌及抗病毒活性[23]。前期试验表明骨髓蛋白具有一定的抑菌活性，这对骨髓中进一步分离鉴定抗菌，抗癌肽等研究提供试验依据。

骨髓和骨质蛋白中药用氨基酸含量均高于其它种类氨基酸总量，其中天门冬氨酸能够增强肝功能，保护心肌；甲硫氨酸参与组成血红蛋白、组织与血清，促进脾脏、胰脏及淋巴功能；亮氨酸能促进胃液分泌。药用氨基酸含量排前四位依次为马骨质蛋白，羊骨质蛋白，马骨髓和牛骨髓蛋白，马骨质蛋白含量比其它种高于2 倍耀6 倍。骨蛋白或多肽关于提高免疫力，补血，治疗关节炎、骨质疏松等作用已有报道[8-9，24]，这些功能可能与其中富含的上述药用氨基酸作用有关。总之，骨髓和骨质蛋白中药用氨基酸含量较高，其营养和药用开发价值需要深入研究。

对于机体发育不成熟的儿童，精氨酸和组氨酸是必需氨基酸。其含量排列前四位的依次为马骨质蛋白，羊骨质蛋白，羊骨髓蛋白，牛骨髓蛋白。民间经常煮羊，牛骨髓或将其加入包子等食品中供给儿童饮食，期望小儿强壮健康成长，能提高免疫力。因此经常食用骨髓、骨质类蛋白能补充新陈代谢和机体生长发育需要的氨基酸，这对含骨髓、骨质类儿童保健食品研发具有一定的指导和促进作用。

3 讨论与结论

3.1 氨基酸种类和含量评价

骨髓粉末、骨髓蛋白、骨质蛋白水解氨基酸总量变幅分别为0.58 mg/g～37.64 mg/g，275.48 mg/g～495.06 mg/g，144.75 mg/g～820.97 mg/g；其必需氨基酸含量变幅分别为0.18 mg/g～8.28 mg/g，90.33 mg/g～179.61 mg/g，117.80 mg/g～623.74 mg/g；羊和马骨质蛋白氨基酸含量高于相应的骨髓蛋白，而牛和骆驼骨髓蛋白氨基酸总量高于相应骨质蛋白。羊[25]、牛[26]、马[27]、骆驼肉[28]中氨基酸总量分别为179.9、219.3、199.10、193.3 mg/g；其必须氨基酸含量分别为72.7、67.7、76.3、80.11 mg/g；除了骆驼骨质蛋白外，其他骨髓和骨质蛋白氨基酸和必需氨基酸总量均高于相应的肉类。戈早川[29]等比较几种动物骨氨基酸组成与含量，其中牛、羊、虎、马鹿、狗氨基酸总量分别为207.46、647、710.1、640.68、497.1 mg/g；其中马鹿骨氨基酸综合指标比较接近于虎骨，本试验中马骨质蛋白氨基酸总量为820.97 mg/g，氨基酸组成比例上也处于优势的位置，可以说在某种程度上能作为虎骨代替使用，这为选择虎骨的替代品提供依据，能促进资源可持续利用程度。但从理化、生化性质等方面需要进一步研究确定。综上，骨质和骨髓蛋白营养全面，具有较高的生物利用价值。

3.2 骨髓和骨质蛋白营养评价

4 种骨髓蛋白第一限制性氨基酸均为异亮氨酸，其AAS 和CS 值分别为0.15 mg/g 耀0.32 mg/g，0.11mg/g耀0.24 mg/g；第二限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，相应值分别为0.20 mg/g耀0.55 mg/g，0.12 mg/g耀0.34 mg/g；骨质蛋白限制性氨基酸与骨髓蛋白恰恰相反、羊肉[25]第一，第二限制性氨基酸分别为亮氨酸（0.08 mg/g），缬氨酸（0.18 mg/g）；牛肉[26]为缬氨酸，蛋氨酸+胱氨酸；马肉[27]为蛋氨酸+胱氨酸，缬氨酸；驼肉[28]为缬氨酸，苏氨酸；肉类与骨骼氨基酸种类和含量上有一定的差异，骨髓和骨质蛋白处于优势位置。其中马骨质和骨髓蛋白化学评分CS 较接近于理想蛋白模式，属于高营养价值的蛋白食品资源。

3.3 氨基酸呈味，极性，带电性及药用性能综合评价

骨髓和骨质蛋白中鲜味、甜味、苦味氨基酸含量变幅为28.39 mg/g耀186.16 mg/g，79.47 mg/g耀356.31 mg/g，36.90 mg/g耀275.60 mg/g；支/芳比值变幅为2.11 mg/g（骆驼骨质蛋白）耀2.65 mg/g（羊骨质蛋白）；其中羊骨质蛋白鲜味和香味氨基酸含量高，与羊肉[25]鲜味和芳香氨基酸（48.5、14.6 mg/g）比较，骨髓与骨质蛋白处于绝对优势。带电荷氨基酸变幅为19.31 mg/g耀137.16 mg/g，带电荷数量与该蛋白与多肽的生理功能具有密切的联系。药用氨基酸变幅为90.47 mg/g耀528.91 mg/g。羊、牛和马肉药用氨基酸含量分别为109.4，160.5、136.3 mg/g，其含量低于相应的骨髓和骨质蛋白；骨髓和骨质蛋白中儿童氨基酸含量变幅为13.30 mg/g耀93.39 mg/g，羊、牛、马、骆驼肉中儿童氨基酸含量分别为21.7、23.5、19.3、17.7 mg/g；其在羊[30]、牛[30]、马[31]、骆驼[32]和人乳[30]中分别为54.56、52.56、1.51 （游离）、69.2、45.10 mg/g，这些数据表明羊和马骨质蛋白的儿童氨基酸含量均高于相应的肉和乳，前期研究显示马骨髓和骨质蛋白中钙、锌含量较高，比例较合理，易于人体吸收。因此马、牛等骨质或骨髓蛋白添加于儿童营养食品中，不仅能调整儿童日常生活钙质不足和钙磷比例失调之外，对于防龋齿，提高智力，以及身体的正常发育均有明显效果，这对开发畜禽骨骼蛋白儿童营养系列产品提供一条新的应用途径。

总之，4 种骨髓和骨质蛋白具有较好的营养价值，是一种优良的营养性动物食品资源。骨质和骨髓蛋白氨基酸总量、种类、配比上高于骨髓粉末，骨质和骨髓蛋白甜味类氨基酸含量均高于鲜味类，骨髓蛋白苦味类含量均高于甜味，而骨质蛋白恰恰相反。羊，牛，马骨质蛋白药用氨基酸和儿童氨基酸含量高于相应的骨髓蛋白和粉末。马骨质蛋白带电荷数较高，马骨髓蛋白E/T 和E/N 比例与FAO/WHO 推荐的理想模式较为接近。骨质和骨髓蛋白作为药用和高营养价值的蛋白质资源，具有较高的开发利用价值和广阔的市场前景，应加大开发力度。

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