超高效液相色谱快速测定饮料中的食品添加剂

◎ 浦艳静

（太仓市检验检测中心，江苏 苏州 215400）

食品工业快速发展，食品添加剂的种类和使用频率逐渐增加。现在，全球范围内能够使用的食品添加剂种类已达到20 000多种，可见，食品添加剂的使用呈快速增长的趋势。在现代食品工艺中，饮料的加工制作可以使用防腐剂、甜味剂、合成色素、咖啡因等众多添加剂。但是，如果这些食品添加剂的使用量超出规定的限值，就会引发一系列食品安全问题，更甚者会危害人们的身体健康。为了保证食品安全，食品添加剂的使用问题引起了人们的广泛关注。现阶段，饮料中食品添加剂的检测方法有很多种，主要包括光度法、毛细管电泳法等，但是这些方法的使用在灵敏度、分辨率、操作方法等各方面存在些许瑕疵。因此，有人提出了超高效液相色谱检测方法，与其他检测方法相比，这种方法有效提升了食品检测过程中的灵敏度、分析速度、分离度，在食品安全分析和检测领域得到了广泛应用，为提升食品质量，保障食品安全起到了十分重要的作用。

1 材料和方法

1.1 样品和试剂的选择

本次实验研究所需要的样品是来自某超市的销售企业所送检的饮料产品，包含碳酸饮料、果汁、茶饮料、含乳饮料共4种。所需试剂包括来自上海安谱公司的乙腈、甲醇、甲酸和乙酸等色谱纯级的化学试剂，所用标准物质采用上海安谱公司的标准物质，实验用水采用从美国MiLLipore公司购进的实验纯水系统制作的一级水。

1.2 标准溶液的制备

按照标准方法配制苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝和咖啡因的标准溶液，具体是分别准确称取25 mg标准物质在50 mL的烧杯中，用少量甲醇-水溶解这些标准物质，然后将这些标准物质定量转移到25 mL的容量瓶中，定容至刻度，避光保存。根据每个不同标准物质的定量限绘制不同浓度的系列标准工作曲线。

1.3 仪器和设备

实验应用ACQUITY UPLC型号的超高效液相色谱仪，该仪器在应用的时候配有二极管阵列检测器和Empower 2色谱数据处理系统、XH-C型涡旋混合器、18K型高速离心机。

1.4 样品前处理

（1）碳酸饮料等含气饮料先称取约5～10 g（精确至0.001 g）置于50 mL烧杯中，再进行加热或超声除去其二氧化碳，然后转移至50 mL的容量瓶中，加入适量的水，超声提取20 min，取出定容到刻度，将样液转移离心管中以4 000 r/min离心10 min，取出，取适量上清液过0.22 μm的滤膜，滤液备用，待液相色谱检测[1]。

（2）乳饮料准确称取约5 g（精确到0.001 g）试样于50 mL带盖离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声提取20 min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2 mL和乙酸锌溶液2 mL，混匀，于4 000 r/min离心10 min，将水相转移至50 mL容量瓶中，于残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，于4 000 r/min离心10 min，将水相转移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22 μm滤膜，滤液备用，待液相色谱测定[2]。

（3）果汁饮料准确称取约5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL带盖离心管中，加水约25 mL，旋涡混匀，超声提取20 min，取出定容到刻度，将样液转移离心管中以4 000 r/min离心10 min，取出，取适量上清液过0.22 μm的滤膜，滤液备用，待液相色谱检测[3]。

（4）茶饮料准确称取约5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL带盖离心管中，加水约25 mL，旋涡混匀，超声提取20 min，取出定容到刻度，将样液转移离心管中以4 000 r/min离心10 min，取出，取适量上清液过0.22 μm的滤膜，滤液备用，待液相色谱检测[4]。

1.5 色谱条件

色谱柱条件是XBridge Peptide BEH C18色谱柱，流动相是甲醇（A）、20 mmol/L乙酸铵溶液（B），流动速度是0.3 mL/min，柱的温度是40 ℃，进样量是20 μL。梯度洗脱程序见表1。质谱基本条件应用电喷雾离子源，具体分为正离子扫描模式和负离子扫描模式；毛细管的电压是4 000 V，雾化气的压力是344.74 kPa，干燥气体的温度是360 ℃，干燥气的流动速度是0.6 mL/min，进样体积5 μL，传输基本电压是110 V，除液电压是65 V。数据信息的获取采用棒状图数据采集模式，扫描的范围在200～500 nm。数据采集和整理之后应用version B.04.00进行定量和定性分析[5]。

表1 梯度洗脱程序表

1.6 实验测定分析

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝和咖啡因食品添加剂保留时间和定量检测波长分析见表2。结合配制好的标准工作溶液，按照从低到高的浓度顺序进行测定，结合多种食品添加剂保留时间和定量检测波长分析表，对各个组分定量检测波长提取相应的色谱图以及各个色谱图对应的组分峰面积、浓度标准曲线。食品添加剂色谱图，如图1所示。

表2 多种食品添加剂保留时间和定量检测波长表

图1 食品添加剂色谱图

2 结果与分析

2.1 色谱分离流动相条件的选择和优化

①缓冲溶液浓度的确定。乙酸铵以其较好的溶解性和不容易在色谱上残留的特点，在食品添加剂检测中经常被人们用来作为缓冲溶液。与一般的液相色谱流动性相比，乙酸铵∶乙腈的流动性较高。在确定实验色谱条件之后分别选择10、20、40 mmol/L的乙酸铵溶液进行实验操作，经过综合比对分析发现20 mmol/L的乙酸铵溶液能够更好地满足分析需求，在节省实验操作时间的同时还能够实现基线分离操作。②色谱分离流动相缓冲盐溶液的酸碱值。色谱分离流动相的酸碱值对分析物的保留时间和峰形有十分重要的影响。在实验操作中发现，加入乙酸后能够有效调节酸碱值。在酸碱值的影响下，组分的峰形也会发生相应的变化，保留时间也发生变化。梯度洗脱中乙酸的初始比例较低，出峰较快、拖尾，因而酸碱值不能过高。加上一些添加剂的组分在4 min左右的时候出峰，酸碱值的选择也不能太低。在综合比较了酸碱值分别在5.5、5.8、6.0、6.5时对应的分离度和峰形影响，发现酸碱值在5.8～6.0时，各组分离和峰形效果最为理想[6]。

2.2 检测波长的选择

各组分经液相色谱分离，二极管阵列检测器扫描检测获得各组分紫外光谱图，根据各个小组紫外吸收情况，在230 nm的波长位置测试苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸和咖啡因；在410 nm的波长位置测试柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红和亮蓝；在256 nm波长位置检测羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯等。

2.3 样品提取方法的确定

饮料中所应用的食品添加剂大多是水溶性材料，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯等防腐剂具有一定的脂溶性，但大多是以钠盐的形式存在。所以，在提取的时候需要在其中加入10%的甲醇溶液，从而达到有效的沉淀作用[7]。

2.4 方法的线性范围和检出限

将食品添加剂组分的混合标准溶液按照一定的方法进行分析，参照峰面积Y对标准样品的质量浓度X进行线性回归分析，由此得到各个类型化合物的线性回归方程。线性回归系数在0.999以上，各个组的线性关系良好，以3倍信噪比计算检出限。

2.5 方法的回收率实验

在一个不含有食品添加剂的样品中添加含量分别是5、10、20 mg/kg的食品添加剂样品，按照相关规定的方法测定，相应的回收率测定实验结果见表3。

表3 相应的回收率测定实验结果表

2.6 精密度实验

对实验样品平行测试5次，具体测试结果见表4。根据对表4的分析发现，RSD的范围在0.66%～2.20%，这种测量方法具有很好的精密度。

表4 精密度实验结果分析表

3 结语

本文应用超高效液相色谱测定饮料中常见的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝和咖啡因食品添加剂，取得了良好的分离效果，定量检测准确、测定通量较高。

[1]王 震，石丽珠.超高效液相色谱-串联质谱测定饮料和酒中防腐剂与甜味剂[J].食品安全质量检测学报，2014，5（4）：1179-1184.

[2]牟 霄，张 璐，张崇淼，等.超高效液相色谱法同时测定饮料中14种食品添加剂[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3177-3184.

[3]江 生，敖菊梅，潘 正，等.高效液相色谱法同时快速测定饮料中的12种食品添加剂[J].分析试验室，2017，36（6）：729-731.

[4]刘印平，路 杨，杨立新，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定饮料中22种添加剂[J].食品安全质量检测学报，2015，6（3）：980-986.

[5]陈沛金，张 毅，肖 锋，等.高效液相色谱法测定糖果、蜜饯和饮料中19种食品添加剂[J].食品安全质量检测学报，2014，5（11）：3487-3494.

[6]杨 静.色谱技术在食品中分析检测及工业化生产中的应用研究[D].济南：山东大学，2014.

[7]刘腾浩.键合钛胶基质整体固定相的制备及应用研究[D].天津：天津商业大学，2014.