发酵乳中乳酸菌计数不确定度的评定

◎ 冯秀娟，邓 军，高俊峰

（宁夏自治区食品检测中心，宁夏 银川 750000）

乳酸菌是一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称[1]。GB19320-2010中规定发酵乳产品中的乳酸菌数不得低于1×106CFU/g（mL），乳酸菌的含量是评价产品对于人们营养与健康作用的重要指标[2]，因而测量结果的可用性值得高度关注。一切定量结果都不可避免具有不确定度，测量不确定度是根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。目前，GB/T27025-2008《检测和校准实验室能力的通用要求》（ISO/IEC17025-2005《检测和校准实验室能力认可准则》）[3-4]指出：适当时，要对测量结果的不确定度进行评定。CNAS-CL09-2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》中也指出：在微生物检测领域，某些情况下，应对测量不确定度进行合理的评估[5]。《实验室资质认定评审准则》中对不确定度也有要求：当不确定度影响对结果符合性的判定时，报告中还需要包括不确定度的信息。本研究依据最新版GB4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[1]的规定对发酵乳中乳酸菌总数进行测定。为保证数据准确可靠，可根据JJF1056.1-2012《测量不确定度评定与表示》与SN/T4091-2015《食品微生物学测量不确定度评估指南》[6-7]中有关规定对乳酸菌总数进行不确定度分析，找出乳酸菌检测过程中的关键控制点[8]，为验证实验室对微生物的检测、计数的准确度和精密度方面的能力提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品、仪器与培养基

样品：市售酸奶。

仪器：生化培养箱（型号：BSP-250），冰箱，均质器，无菌均质袋，立式自动压力蒸汽灭菌器（GR850DF，致微仪器有限公司），厌氧袋，天平，无菌试管，无菌吸管，生理盐水。

培养基：MRS培养基，MC培养基。

1.2 检测方法

1.2.1 取样与稀释

样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。称取酸奶样品25 g于装225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min制成1∶10的样品匀液。用1 mL无菌吸管吸取1∶10的样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中，制成1∶100的样品匀液，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管。

1.2.2 稀释倍数选择

根据平常实验经验，酸奶中乳酸菌计数（GB4789.35-2010版标准）一般选择10-5、10-6稀释度，根据GB4789.35-2016，本实验选择10-6、10-7、10-83个稀释度。

1.2.3 倾注平板、培养与计数

将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入有稀释液的平皿中，转动平皿混匀。（36±1）℃厌氧培养（72±2）h。培养后计数平板上的所有菌落数。

2 结果与分析

2.1 结果报告原则

选取菌落数在30～300 CFU、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，单位CFU/mL。

2.2 建立数学模型

由于只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，因此计算该稀释度平板上的菌落数乘以该稀释度，即为乳酸菌计数结果，公式为：

式（1）中：N为样品中菌落数；X为平板上的菌落数；d为稀释度。

2.3 不确定度的来源

检测中不确定度的来源主要有：样品本身的均匀性、取样的重复性、操作者、培养时间、设备、培养基、试剂及玻璃量具等。与一般的侧量比较，微生物同一样品重复测量的结果相差极大，即结果的分散性较大。随机效应带来的样本重复性偏差是获取测量不确定度的主要因素，即A类评定。本实验主要采用A类评定测量不确定度，同时考虑了B类不确定度对合成不确定度的贡献。

2.4 不确定度的评定

2.4.1 同一样品的重复测量结果的不确定度评定

依据GB 4789.35-2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行检验，在重复性条件下对同一个酸奶样品进行了10次独立性测试，由于乳酸菌的数量分布在108和109数量级，计算出的样本标准差很大，因此对实验数据取对数后进行计算[9-12]，结果和中间计算值，见表1。

表1 重复测量结果和中间计算值表

合成标准不确定度等于1倍的标准偏差，即：

根据置信概率p=95%和自由度ν=9，由t分布表得到包含因子k=2.26，于是得：对数计算结果：

2.4.2 一组样品的重复测定结果的不确定度评定

随机选取10份酸奶样品，各样品由不同人员进行试验，同一样品由同一人员进行2次试验。中间计算值及对数计算结果，见表2。

表2 10份酸奶样品乳酸菌测量结果及中间计算值表

合并样本标准差：

因为每一样品测量2次，所以2次测量结果平均值的实验合并标准差为：

根据置信概率p=95%和自由度ν=10，由t分布表得到包含因子k=2.23，于是得：

2.4.3 B类不确定度的评定

主要考虑样品制备过程中称量、玻璃量具（含温度校正）、稀释过程、接种过程等引入的不确定度。

2.4.3.1 样品制备过程中引入的相对标准不确定度

（1）称量。所用天平最大量程为1 000 g，允许误差为0.1 g，称取25.0 g样品，测量仪器最大允许误差导致的不确定度属于均匀分布，所以由天平称量引入的相对标准不确定度为：

（2）玻璃器皿及温度所用250 mL无菌量筒量取225 mL无菌生理盐水缓慢加入称量好的25.0 g样品中，根据JJG196-2006[13]中规定，20 ℃时量出式量筒的容量允许差为2.0 mL，按照三角分布考虑，k=6，由此估算量筒的允许误差引入的相对标准不确定度为：

在实验室室温为25 ℃时取样，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，按均匀分布温度引入的相对标准不确定度为：

（3）均质器将制备好的样品进行均质，每个样品按GB4789.35-2016中规定均质速度和时间进行均质，可认为由均质引入的不确定度可忽略不计。

样品制备过程中引入的不确定度由电子天平、量筒和温度产生的相对标准不确定度合成，故：

2.4.3.2 样品稀释过程中引入的相对标准不确定度

样品稀释过程中引入的不确定度主要是由1 mL流出式吸量管（B级）引入的不确定度。按照JJG196-2006《常用玻璃量具检定规程》的要求，均有相应的最大允差，按照三角分布考虑，k=，由此估算相对不确定度分量，见表3。本实验过程中，试验温度与鉴定证书的温度一致，

因此温度引起的容量瓶体积不确定度可忽略。

表3 样品稀释过程中量具校准引起的不确定度表

2.4.3.3 样品接种过程中引入的相对标准不确定度

选取适宜稀释度的样品1 mL加入无菌培养皿中，实际取样1 mL待测样品时的相对标准不确定度：

2.4.3.4 合成不确定度

B类各相对标准不确定度分量，见表4。

表4 相对标准不确定度分量表表

B类合成不确定度：

2.4.4 合成A类与B类不确定度

（1）同一样品重复测量

相对A类不确定度B类的贡献为：

（2）一组样品的重复测定

合成不确定度：

相对A类不确定度B类的贡献为：

3 讨论

通过本次对乳酸菌不确定度的评定可知，影响乳酸菌检测的因素很多，除样品制备过程中量具、培养条件、培养基等外，主要表现为同一样品同一人重复测定的检测结果与同一组样品平行测定的结果发散性较大，即发散是引起不确定度的主因，而B类不确定度占同一样品重复性检测所引起不确定度的24%，占一组样品合并样本标准差引起不确定度的13%。由此可见，B类不确定度对乳酸菌检测的合成不确定度的贡献比最大分量的1/3还小，可忽略不计。因此，日常工作中只需要考虑重复检测所引入的不确定度。与此同时，为节省时间、降低成本，当样品检测结果发散性很大时，可采用合并样本标准差求检验结果的不确定度，根据每次新积累的实验数据，重新计算合并样本标准差，更新不确定度的取值范围。

[1]国家食品药品监督管理总局.GB4789.35-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验乳酸菌检验[S].北京：中国标准出版社，2016.

[2]谢继志，肖宏彬.酸奶中乳酸菌数及酸度的检测与评价[J].中国乳品业，2002，30（1）：22-25.

[3]全国认证认可标准化技术委员会.GB/T27025-2008检测和校准实验室能力的通用要求[S].北京：中国标准出版社，2008.

[4]全国认证认可标准化技术委员会.ISO/IEC17025-2005中国实验室国家认可委员会检测和校准实验室能力认可准则[S].北京：中国标准出版社，2005.

[5]中国认证认可标准化技术委员会.CNAS-CL09-2013检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明[S].北京：中国标准出版社，2013.

[6]国家质量监督检验检疫总局.JJF1056.1-2012测量不确定度评定与表示[S].北京：中国标准出版社，2012.

[7]国家质量监督检验检疫总局.SN/T4091-2015食品微生物学测量不确定度评估指南[S].北京：中国标准出版社，2006.

[8]李玉玲，宋莉莉.食品微生物学菌落总数检验中不确定度的评定[J].中国卫生检验杂志，2005，15（7）：880-896.

[9]杨 燕，李琼琼，宋光艳，等.能力验证乳粉中乳酸菌计数不确定度的评定[J].食品安全质量检测学报，2016，7（7）：2747-2750.

[10]李 莎，谭 震.酸乳乳酸菌数检验中不确定度的评定[J].中国卫生检验杂志2012，22（8）：1864-1865.

[11]水 明，张学林.酸牛奶中乳酸菌数的测量不确定度的评定[J].中国牛奶，2007（4）：38-39.

[12]王海华，兰 茜.能力验证菌落总数测定结果不确定度的评定[J].食品安全质量检测学报，2015，6（6）：2354-2355.

[13]国家质量监督检验检疫总局.JJG196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006.