运用SAN++型连续流动分析仪测定水稻无机磷含量

(浙江大学生命科学学院植物所，植物生理学与生物化学国家重点实验室，杭州 310058)

水稻无机磷含量是水稻磷吸收代谢能力的重要指标。很多水稻磷相关基因突变体研究中都涉及无机磷含量的测定[1]，还有很多磷相关突变体就是通过叶片无机磷测定来筛选和基因定位[2,3]，因此水稻无机磷的测定是水稻磷相关途径研究的重要方法，其准确性将直接影响磷相关基因功能的研究。

目前水稻无机磷的测定主要采用吸光度法，样品使用硫酸或者高氯酸消解后，采用孔雀绿法或者钼蓝法进行测定[4，5]。这些方法步骤较多，需要分液稀释后逐个加入反应液，进行显色反应，步骤繁琐，耗时较多，尤其是样品量很大时，准确度也得不到保证。连续流动分析仪是一种新型的分析仪器，自动化分析，具有操作简单、结果准确等优点，目前已在不同领域发挥重要作用。如连续流动分析仪测定植物全氮、全磷、全钾[6，7]；土壤中全氮、有效磷[8]；有机肥料中全氮[9]；稻米直链淀粉[10]；水质分析[11，12]等，但使用连续流动分析仪测定水稻无机磷含量尚未有报道。本研究应用SAN++型连续流动分析仪分析了不同水稻磷相关突变体的无机磷含量，并对仪器测定结果的准确度进行了分析，建立了一种快速、简便、准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 方法原理

水稻组织破碎后，用5M硫酸提取无机磷，在酸性条件下，磷酸根与钼酸铵形成锑磷钼混合杂多酸，在酒石酸锑钾的催化下，被抗坏血酸还原成钼蓝，在880nm比色测定吸光度，利用钼蓝质量浓度与吸光度呈正比定量测定。

1.2 材料与试剂

(1) 2mL离心管(国产)，15 ml离心管(国产)，小剪刀，10mL分液器，9mm定性滤纸；

(2) 连续流动分析仪(荷兰SKALAR)，荷兰SKALAR公司生产，配置自动进样器；球磨仪(莱驰)，德国莱驰生产；

(3) 5 M硫酸：650mL Milli-Q水中缓慢加入272mL 98%硫酸(分析纯)，并不断搅拌，冷却后定容到1000mL；

(4) 无机磷测定反应液：

反应液I：800mL Milli-Q水缓慢加入25mL 浓硫酸(分析纯)，并不断搅拌，定容到1000mL；

反应液P4：800mL Milli-Q水加入2mL FFD6(Skalar，cat.No：13909)，并不断搅拌，定容到1000mL；

反应液C2：800mL Milli-Q水缓慢加入40mL浓硫酸(分析纯)，并不断搅拌，定容到1000mL；

反应液G：800mL Milli-Q水加入18 g抗坏血酸(分析纯)，并不断搅拌，加入20mL酒石酸锑钾母液，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根据测定工作量配置合适体积；

反应液E：800mL Milli-Q水加入4.8 g钼酸铵(分析纯)，并不断搅拌，加入40mL 酒石酸锑钾母液，并加入2mLFFD6，定容到1000mL，4℃保存，最多保存2周，可根据测定工作量配置合适体积；

(5) 无机磷母液(1000 mg/L)：800mLMilli-Q水加入4.875 g NaH2PO4·2H2O(分析纯)，并不断搅拌，定容到1000mL；

(6) 酒石酸锑钾母液：80mL Milli-Q水加入300 mg酒石酸锑钾(分析纯)，并不断搅拌，定容到100mL，4℃保存；

1.3 植物材料

(1)水稻秧苗。野生型Nipponbare(Nip)种子露白后种到网纱板上，正常营养液培养21天，每3天换一次营养液。

(2)取21天苗龄水稻倒二叶和根进行测定。

1.4 样品处理

(1)根据测定样品数量，取国产2mL离心管并编号，每个离心管称重并记录。

(2)取水稻倒二叶或根，尽量剪碎，并放入称重编号的2mL离心管中，取完样品后，离心管和样品一起称重，并记录，算出样品质量。样品50～100 mg为宜。

(3)加入氧化锆珠子(直径5mm，淘宝有售，铁珠子会被硫酸腐蚀)，并加入500μL5M硫酸，使用球磨仪24 frequency 1/s 频率震动研磨2min，磨碎叶片，直至成为均匀匀浆(可多次打样)。

(4)使用分液器在每个磨碎的样品中加入5mL Milli-Q水，并转移到15mL离心管中，颠倒混匀。并使用500 μL 5 M硫酸和5mL Milli-Q水做2个空白对照。

(5)按照常规方法折叠9mm定性滤纸，将上述裂解液使用滤纸过滤到连续流动分析仪自动进样器配套的进样管中。

(6)过滤好后，按照顺序放到自动进样器相应的位置上，2个空白首先放置。

1.5 标准溶液配置

使用100mL容量瓶，加入80mL反应液I后，分别加入125 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL、3000 μL无机磷母液，用反应液I稀释至刻度，得到1.25 mg/L，2.5 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L梯度的标准溶液。

1.6 上机测定

(1)开机后，所有管路连接Milli-Q水，清洗管道5min后，5条进液管道分别加到装有反应液I、P4、C2、G、E的反应瓶中，进行预反应，此时打开“FlowAccess”软件，设定到Total P测定的程序上，并打开读数页面，此时读数应在70～75万之间。

(2)在流动分析仪预热过程中，分别将6个标准溶液倒入进样管中，体积至少3mL，否则会因为液面太低吸不到标液。同时按照测定样本的数目，准备好漂移校准液(20 mg/L标准溶液)，每测定10个样品，测一次漂移校准液，每次吸取750 μL左右，每个进样管吸5次。

(3)当流动分析仪进样系统各个管道流速均一，基线稳定时，软件中点击Start按钮，开始测定。

(4)全部测定完成后，根据测定结果和样品质量，按照式(1)计算出所测样品中的无机磷浓度ω：

ω=(ρ×V) / (m×1000)

(1)

式中：

ρ—试样溶液中的无机磷浓度，mg/L；

V—试样溶液总体积，5.5mL；

m—称取水稻叶片的质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

按照标准配置标准溶液后，使用连续流动分析仪测得的标准曲线图和峰形图见图1和图2。从图1可以看出，标准溶液浓度在0～30 mg/L时，无机磷浓度与测定峰值之间形成很好的线性关系，相关系数可以达到0.9999，拟合方程为：y= 59188.13x- 30762.91(r2=0.9999)，其中y为标准系列峰高度，x为标准系列磷浓度(mg/L)。

图1 标准曲线图

图2 标准溶液峰形图

从峰形图可以看出，标准溶液曲线峰形平滑，没有杂峰，这说明反应时间和其他反应条件均在比较适宜的范围内，符合试验稳定性要求。

2.2 精密度检测

用质量浓度分别为1 mg/L，6 mg/L，15 mg/L的3个代表低、中和高质量浓度的样品各测定10次，计算相对标准偏差(表1)。精密度RSD在0.86%～3%之间。

表1 精密度测定结果

2.3 加标回收率实验

配置浓度为15 mg/L的磷标准溶液，取5 ml样品溶液分别加入1mL不同浓度的磷标准溶液，定容到10mL后混匀，使用连续流动分析仪测定其浓度，根据浓度计算加标回收率，结果见表2。从表2可以看出，测得加标回收率在96.8%～108.5%之间，平均加标回收率为102.6%，说明该方法符合实验准确度要求。

表2 加标回收率实验结果

2.4 已知磷相关材料磷测定分析

分别对正常营养液(200 μM磷)和低磷营养液(10 μM磷)处理14天的水稻叶片和根的无机磷含量进行了测定，结果见图3。从结果可以看出，无论是正常还是低磷处理的叶片，使用连续流动分析仪测定无机磷，都能得到好的结果。

图3 正常和低磷条件下无机磷测定

根据文献报道，pho2、PHR2(O)、spx1、spx2、spx4等水稻材料无机磷含量高于野生型，phf1水稻材料无机磷含量低于野生型。使用连续流动分析仪对上述磷相关材料叶片进行无机磷测定分析，结果见图4。

图4 不同磷相关材料叶片无机磷测定

根据流动分析仪测定结果(图4)，无机磷含量高的磷相关突变体pho2、PHR2(O)、spx4等材料无机磷含量都显著高于野生型，其中pho2材料磷含量最高，PHR2(O)次之，spx4材料磷含量比PHR2(O)要低；磷含量低的突变体phf1材料无机磷含量比野生型低，测定结果及趋势与文献报道一致[1-3]。上述结果表明，连续流动分析仪可以用来进行磷相关材料的无机磷测定。

3 讨论

SAN++型连续流动分析仪测定无机磷浓度，使用的是钼锑抗法，该方法显色快，颜色稳定，灵敏度较高，对干扰离子的允许量较大，从标准曲线、准确度分析和加标回收结果来看，该方法标准曲线峰形平滑，回归线性好，精密度在0.86%～3%之间，能够满足实验需要。而且虽然钼锑抗法测定磷浓度没有孔雀绿法灵敏度高，但是水稻叶片和根部的无机磷含量并不低，使用孔雀绿法时，反而会因为灵敏度太高而需要高倍稀释，造成不便。流动分析仪使用自动进样装置，在连续、大批量无机磷测定时省时、省力，而且避免了人工操作带来的误差，在目前基因组学、表型组学研究中大有用途。

连续流动分析仪在使用过程中，需要不定期进行维护、清洗，否则会出现问题。首先仪器进样管道要定期使用次氯酸钠清洗，而且要根据使用频率不定期更换，否则会影响测定准确度，严重时会导致峰形变差，甚至会出现不起峰现象；其次反应试剂配置要准确。由于反应试剂中需要使用浓硫酸，为了安全起见，反应I、C2可以一次性大量配置，多次分装使用，避免多次接触浓硫酸，反应液G、E由于是反应底物和催化剂，对结果影响大，需要仔细配置，而且因为试剂稳定性原因，每次少量配置，低温保存，最多放置2周。

4 结论

San++连续流动分析仪测定水稻无机磷操作简单、分析速度快、准确度高，尤其是大量测定时更加具有不可替代的优势，在水稻磷营养相关研究中应用前景广阔。

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