毛细管电泳法分离9种磺胺类药物

(1.深圳市福田区疾病预防控制中心，深圳 518040；2.深圳大学药学院，深圳 518060；3.深圳市宝安区疾病预防控制中心，深圳 518100)

磺胺类(sulfonamides)药物在1932年被德国的杜马克首次应用[1]，是一类含有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，主要通过与对氨基苯甲酸竞争性结合二氢叶酸合成酶，影响细菌核蛋白合成而发挥抑菌作用[2，3]，该类药物已有超过70 年的使用历史，具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等优点，无论在临床还是兽药领域，该类药物均有着极其广泛的应用[4-6]。目前磺胺类药物的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[7-12]、免疫胶体金法[13]、ELISA 检测试剂盒法[14]、薄层色谱法[15]以及高效液相色谱质谱联用法[16]等。在磺胺类药物的HPLC分离中，除了甲醇和乙腈等流动相，还需要添加乙酸等物质来改善拖尾[17-20]，较为繁琐，且HPLC自身的溶剂消耗量较大，污染大。

毛细管电泳(CE)兼有高压电泳及微柱液相分析的特点，其运行溶液多为水和无机盐，样品消耗量在纳升级别，具有分析速度快、分离效率高(比HPLC高1～2数量级)、分离模式多，样品和试剂消耗少、污染小等特点，是一种低运行成本的高效分离方法。文献报道的磺胺类药物CE分析方法中，部分需要特殊的检测器，如电导或化学发光检测装置[21-25]，或复杂的缓冲溶液体系[26，27]，分离对象多局限于3种左右的磺胺类药物。本实验建立了直接以磷酸盐缓冲液为运行溶液，同时测定多达9种磺胺类药物的方法，并用于滴眼液和兽药药粉中相应药物成分的含量测定，取得了良好效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman Coulter instruments，Fullerton，CA，USA)，配备二极管阵列检测器、32Karat 7.0工作站；熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)，内径75μm，外径365μm；磁力搅拌器(IKARCT基本型)；酸度计(型号S20)；蜗旋混匀器(型号MS3)；超声仪(Elmasonic S 100H，Germany)；氢氧化钠、盐酸、十水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、硼砂、硼酸、柠檬酸钠和柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲噻二唑、磺胺间二甲氧嘧啶对照品购自中国食品药品检定研究院；思芬牌磺胺醋酰钠滴眼液购自武汉五景药业有限公司(批号17080201)；博立达牌复方磺胺氯哒嗪钠粉购自江西博莱大药厂有限公司(批号20170609)。

1.2 缓冲液及样品制备

缓冲液配置方法如下: 分别配制pH 5.5、6.5、7.5和9.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液，20mmol/L硼砂-硼酸缓冲液和20mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

磺胺类药物标准品制备方法如下：分别取适量磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲噻二唑、磺胺间二甲氧嘧啶粉末，以50%甲醇溶液为溶剂配置成不同的浓度。

磺胺醋酰钠滴眼液样品制备方法如下：取滴眼液1.0mL，用50%甲醇溶液定容至1.0 L，摇匀。然后取1.0mL，用50%甲醇溶液定容至10mL，过0.2μm滤膜，进样分析。

复方磺胺氯哒嗪钠粉样品制备方法如下：取样品约0.5 g，精密称定，置100mL量瓶中，加水50mL，然后搅拌5min，超声5min，加甲醇50mL，摇匀；精密量取5mL，置500mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；过0.2μm滤膜，进样分析。

1.3 毛细管电泳分析方法的建立

毛细管电泳分析条件如下：137.9 kPa压力下，用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、电泳缓冲液冲洗毛细管各5分钟，预电泳平衡5分钟。样品在3.45 kPa压力下进样3秒，然后电泳分离，柱温为20℃，检测波长210nm。

2 结果与分析

2.1 电解质种类对9种磺胺类药物分离效果的影响

考察电解质种类对分离效果的影响，结果如图1所示。在20 mM磷酸盐缓冲溶液中，21min以内9种磺胺类药物基本分离，各峰峰型对称尖锐，柱效高，分离效果较好。在20 mM硼砂缓冲溶液中，电渗流增强，分析时间缩短至12分钟，但各组分的分离度降低，大量组分无法分离，且峰高降低。在20mM柠檬酸盐缓冲溶液中，不仅分析时间延长至30min，各峰的峰宽明显增加，分离效率下降，组分之间出现了峰合并。

综上所述，选择磷酸盐缓冲液作为优化的运行缓冲液。为了确定各峰的归属，分别将各个磺胺药物进行电泳分析。通过比对迁移时间、峰形与紫外可见吸收光谱(190nm～600nm范围)，得到磷酸盐电泳缓冲液中9种磺胺药物的归属，如图1所示。

2.2 缓冲液pH值对磺胺类药物分离效果的影响

缓冲液pH值影响着分析物的电泳淌度和电渗流大小，是电泳过程中重要的优化参数。研究考察了在磷酸盐缓冲溶液中，pH 5.5～9.0的范围内，9种磺胺类药物的分离效果，结果如图2所示。在偏酸性(pH5.5)或碱性(pH9.0)的条件下，磺胺类药物的出峰数目减少，并出现峰合并现象。在pH6.5 条件下，磺胺二甲嘧啶和磺胺氯哒嗪无法分离。在pH7.5条件下，9种磺胺类抗生素得到基本分离，分离效果较好。因此选择pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液作为优化的电泳条件。

图1 电解质种类对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; 电压: 8 kV; pH值: 7.5峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.

图2 缓冲液pH值(磷酸盐缓冲溶液)对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; 电压：8 kV峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.

2.3 不同分离电压对磺胺类药物分离效果的影响

分离电压直接影响毛细管内电渗流和分析物电迁移速率的大小，从而影响分析时间和分离效率。研究考察了在pH7.5的磷酸盐缓冲液中，分离电压5 kV～12 kV范围内，9种磺胺类药物分离效果。结果如图3所示。当分离电压为5 kV时，分析时间长达37mins，9种磺胺类药物峰型过宽，柱效较低。当分离电压为8 kV时，分析时间几乎缩短一半，9种磺胺类抗生素峰形尖锐，分离情况最好。当分离电压为12 kV时，虽然分析时间缩短至15min，但分离度下降明显。因此，选择8 kV作为优化的电压条件。

图3 分离电压对标准品分离效果的影响各标准品浓度: 0.02 mg/mL; pH值:7.5峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.

2.4 方法学评价

对5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和60 μg/mL的9种标准品进行电泳分析，以浓度(μg/mL,X)对峰高(Y)进行线性回归，9种物质线性关系良好。以3倍信噪比(S/N)对应分析物浓度作为检出限，10倍信噪比对应分析物浓度作为定量限，9种磺胺药物的相关数据如表1所示。

表1 9种磺胺类药物线性回归数据、检出限和定量限

2.5 样品测定

为了考察方法在药物含量检测中的应用，测定了兽药药粉中磺胺氯哒嗪钠以及滴眼液中磺胺醋酰钠的含量。博立达牌复方磺胺氯哒嗪钠粉购自江西博莱大药厂有限公司(批号20170609)，包装标识规格：1000 g药粉含磺胺氯哒嗪钠625 g和甲氧苄啶125 g。药粉经简单溶解和稀释后，可以直接进样分析，其样品电泳图如图4(a)所示，该药粉的辅料及其他成分不影响检测，杂峰与目标峰完全分离，用本方法测得药粉中磺胺氯哒嗪钠的含量为0.619 g/g，与标示量(0.625 g/g)基本相符。思芬牌磺胺醋酰钠滴眼液购自武汉五景药业有限公司(批号17080201)，滴眼液稀释后进样，只有目标峰出现，无任何干扰峰，用本方法测得滴眼液中磺胺醋酰钠含量为0.142 g/mL，与标示量(0.15g/mL)基本相符。

图4 复方磺胺氯哒嗪钠粉样品电泳图(a).复方磺胺氯哒嗪钠粉样品；(b).磺胺醋酰钠滴眼液样品；(c).9种磺胺药物混合标准品 标准品浓度：0.02 mg/mL峰鉴定: 1.磺胺二甲嘧啶; 2.磺胺氯哒嗪; 3.磺胺吡啶; 4.磺胺醋酰; 5.磺胺噻唑; 6.磺胺甲基嘧啶; 7.磺胺喹恶啉; 8.磺胺甲噻二唑; 9.磺胺间二甲氧嘧啶.

3 讨论与小结

使用毛细管电泳和DAD检测器，建立了同时检测9种磺胺类药物的方法。在优化的电泳条件下，9种磺胺类药物成分基本分离，具有良好的线性关系。使用该方法测定了眼药水和兽药药粉中磺胺类药物含量，与标示含量一致。本方法简单、快速、准确，适用于磺胺类药物成分的快速检测。

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