分析保护剂对中药材桂皮中有机氯农药残留检测基质效应的补偿作用研究

(梧州出入境检验检疫局，梧州 543002)

中药材是中华民族自古以来防治疾病的传统特色药物,在中华文明的历史进程中发挥了重要的作用，时至今日中医中药材仍然是患者去除疾病的重要手段之一。随着现代农业技术的推广，除部分中药材为野生采摘外，大部分植物源性中药材已实现人工育苗，种植。城镇化的快速推进和工业化污染的日益加重，土地上农作物的安全、卫生状况不断引发全社会的持续关注，人们对农产品中农药残留危害性的认识进一步增强，中药材中的农药残留分析显得日益重要。有机氯农药是一类曾被世界各国广泛使用的高效广谱杀虫剂,属于神经毒物和实质脏器毒物,可致癌，但由于它的分子结构稳定,在自然环境中不易降解，致使在禁用10 余年后,仍能在水域、土壤和生物体内找到残留[1]。美国、日本、韩国、欧盟等国家及中国香港、台湾地区均对中国出口中药材中的有机氯残留提出了限量要求[2]。

肉桂历来是广东、广西两地传统大宗出口产品，产量占我国肉桂产量的95%以上，在中医药行业，肉桂有着悠久的药用历史，现存最早的秦汉时期的《五十二病方》中，关于肉桂的使用就有十三方[3]；相对于常见的中药材样品农药残留检测，桂皮样品有机提取液基质非常复杂且干扰化合物较多，含挥发性成分高，富含大量醛、醇类极性物质，主要成分为反式肉桂醛、反式邻甲氧基肉桂醛、肉桂酸及部分烯类、醇类化合物[4，5]，检测过程中若不考虑基质效应将会对检测结果产生较大的影响，影响定量结果的可靠性。基质效应即样品中除待测物以外的其他基质成分对待测物的测定产生影响，会导致检测结果的准确性[6-7]。一些文献中对水果、蔬菜、粮食中基质效应的报道较多[8-13]，对中药材特别是芳香性中药材如桂皮农药残留检测中的基质效应的研究还未见报道。本实验选取芳香性中药材肉桂皮为研究对象，分析了在检测肉桂皮有机氯农药残留过程中产生的基质效应，有针对性的提出加入分析保护剂以最大程度地减少基质效应。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦7890A气相色谱仪(美国安捷伦公司)，微电子捕获检测器μECD及G4513A自动进样器，安捷伦超高惰性衬管(5190-3165)；漩涡震荡混合仪(美国TALBYS)；TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；WK-1000A高速粉碎机(青州市精城医药设备制造有限公司)；氮吹仪、固相萃取装置、六六六BHC(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC)、滴滴涕DDT(PP-DDE、OP-DDT、PP-DDD、PP-DDT)混合标准液(100μg/mL，美国Dr公司)、L-古洛糖酸-γ-内酯(L-Gulonic Aicdγ-Lactone，CAS:1128-23-0，纯度98%)、3-乙氧基-1,2-丙二醇(3-E thoxy-1,2-propanediol，CAS No: 1874- 62- 0，纯度98%)均购自上海安谱科学仪器有限公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、石油醚(沸程60～90℃)均为色谱纯；无水硫酸钠经马弗炉650℃灼烧4小时，于烘箱中120℃烘烤2小时，冷却后密闭置于干燥皿保存备用。

固相萃取柱：CNWBOND SAX/PSA 500mg/500mg,6mL，CNWBOND Florisil柱500mg/6mL，均购自上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 仪器条件

色谱柱：DB-1701弹性石英毛细管柱(30m×0.35mm×0.25μm)；载气：高纯氮气(纯度99.999%)；进样口温度250℃；检测器温度300℃；尾吹流量：60mL/min.；柱流量：3mL/min；不分流进样，进样量：1μL；定量方法按峰面积外标法定量。

升温程序：初始温度100℃，以10℃/min.升至180℃，再以5℃/min.升至240℃，保持10min.。

1.3 样品制备

为避免每次前处理过程添加标准溶液时引入的操作误差及实验器皿误差，本实验按以下方法制备模拟阳性样品：肉桂皮样品约300g，挑拣出杂质后制成约1cm×1cm碎块，置于800mL大烧杯中，倒入500mL预先配置好的六六六、DDT混合标准溶液(正己烷定容，浓度为1.0μg/mL)，充分搅拌均匀浸泡24小时后放入通风橱，抽风赶去烧杯中正己烷，在通风橱中放置一张干净牛皮纸，将烧杯中桂皮平铺在牛皮纸上，继续抽风至桂皮样品干燥后用高速粉碎机粉碎后置于玻璃试剂瓶中备用。

1.4 六六六、DDT标准液制备

以正己烷为溶剂，将六六六、DDT混标液稀释至10μg/mL，再精密吸取适量，配制成浓度为0.1μg/mL 、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的工作液。

1.5 样品前处理

1.5.1 提取

称取0.5g肉桂皮样品于15mL塑料离心管中，加入1mL蒸馏水充分湿润30min，加入2g无水硫酸钠，以石油醚∶丙酮=9∶1(体积比,下同)2mL×3次在漩涡混合仪上漩涡振荡提取，每次3min，于离心机上离心2min(4000rpm/min)，合并3次上清液，待净化。

1.5.2 净化

SAX/PSA固相萃取柱上以湿法填入1cm高无水硫酸钠，下接Florisil柱，以6mL正己烷淋洗小柱，弃去淋洗液，移入提取液，先以4mL正己烷分两次洗脱，再以6mL正己烷∶乙酸乙酯=9∶1(体积比)分3次洗脱，控制提取液及洗脱液的流速在1mL/min左右，收集全部流出液于10mL带刻度玻璃离心管中，40℃在氮吹仪上浓缩近干，用甲醇定容至1mL，上机测定，淋洗、上样过程中需注意不能使液面流干。

2 结果与讨论

2.1 分析保护剂的选择

最简单的解决方法是选择不含待测目标物的空白样品基质配制标准溶液，以此来补偿标准溶液和样品溶液中标物的响应，但该法在日常检测工作中却存在两个问题：首先是不含待测目标物的空白基质样品不易获得，需在前期进行大量的筛选工作，耗费大量的人力物力及时间，产生大量的有机溶剂废液污染环境；其次是实验室每天接收的农产品、食品、中药材等样品种类五花八门，若需要匹配与每个种类基质相同的空白基质样品，将大大增加日常工作量，影响了检测工作效率的提高。在参考有关文献的基础上[14]，本实验选定L-古洛糖酸-γ-内酯、3-乙氧基-1,2-丙二醇作为分析保护剂。称取L-古洛糖酸-γ-内酯100mg，加入2mL水溶解，以甲醇定容至10mL，过0.45μm有机相滤膜后冰箱保存，浓度为10mg/L；称取3-乙氧基-1,2-丙二醇100mg，以甲醇定容至10mL，冰箱保存,浓度为10mg/L。通过在实验数据的对比并参考有关文献[15，16]，发现3-乙氧基-1,2-丙二醇对基质效应的补偿作用不及L-古洛糖酸-γ-内酯，故本实验选定L-古洛糖酸-γ-内酯作为分析保护剂。

2.2 分析保护剂浓度的选择

移取适量L-古洛糖酸-γ-内酯工作液，用甲醇配制成8个浓度的L-古洛糖酸-γ-内酯添加液：0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL，各取50μL加入按1.5样品前处理方法得到的净化液中，于漩涡震荡器上充分混匀，上机测定，以L-古洛糖酸-γ-内酯添加液浓度为横坐标，以目标物峰面积为纵坐标，比较浓度与峰面积关系，如图1。

图1 L-古洛糖酸-γ-内酯浓度与六六六、DDT峰面积响应关系

从图1中可看出，在添加量恒定时，L-古洛糖酸-γ-内酯添加液的浓度为2.5mg/mL时，六六六、DDT的峰面积响应值达到了理想状态，而随着浓度的进一步提高，虽然峰面积有一定程度增加，但基线随之大幅升高，从而给目标峰的积分带来负面作用，故选定2.5mg/mL作为L-古洛糖酸-γ-内酯添加液的浓度。

2.3 分析保护剂的添加量

分别取10μL、30μL、50μL、70μL、90μL、110μL、130μL、150μL浓度为2.5mg/mL的L-古洛糖酸-γ-内酯添加液，加入按1.5样品前处理方法得到的净化液中，于漩涡震荡器上充分混匀，上机测定，以L-古洛糖酸-γ-内酯添加量为横坐标，以目标物峰面积为纵坐标，比较添加量与峰面积关系，如图2所示，随着添加量的增加，六六六、DDT的响应值在添加量在90μL处达到最大值，而继续添加保护剂，六六六、DDT的响应值反而降低，说明过量加入保护剂，一方面容易在进样口及衬管内表面造成更多的难挥发性有机物的累积，因为基质效应主要发生在从进样口到色谱柱以及色谱柱到检测器之间[17，18]，在配制L-古洛糖酸-γ-内酯工作液时需加入少量的水溶解，于净化液中过量加入保护剂，进入色谱系统中的微量水分会削弱保护剂与目标物竞争衬管中活性点位时的竞争力，对目标物在ECD检测器上的响应造成一定程度的影响。

图2 L-古洛糖酸-γ-内酯体积与六六六、DDT峰面积响应关系

2.4 线性关系

分别以纯溶剂、空白基质提取液配制浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的标准溶液，各取1mL装入进样瓶，加入2.5mg/mL 的L-古洛糖酸-γ-内酯添加液90μL，在漩涡振荡器上充分混匀，上机测定，考察纯溶剂标准溶液添加保护剂、空白基质标准溶液两者之间的线性关系，结果如图3，两者的相关系数非常接近，均达到0.99以上，表明在纯溶剂配制的标准溶液中添加适量保护剂完全可以取代以基质提取液配制的标准溶液，尽可能消除因基质效应影响定量准确度的因素，大大提高了工作效率，避免产生大量的有机溶剂废液污染环境。

图3 溶剂标准溶液加保护剂、基质标准溶液两者之间的线性关系

2.5 方法检出限、回收率、精密度

取空白基质肉桂皮样品0.5g，加入3个浓度水平的标准液，按照1.5节处理方法进行样品前处理，按上述优化的保护剂L-古洛糖酸-γ-内酯浓度及添加量加入保护剂，进行测定，每个水平测定5次，计算加标回收率及相对标准偏差，结果见表1。结果表明，六六六的加标回收率为95.5%～98.0%，相对标准偏差为3.23%～7.59%，检测限(以3倍信噪比计)为4.5×10-3～1.6×10-2mg/kg；DDT加标回收率为95.5%～100.5%，相对标准偏差为3.17%～4.36%，检测限(以3倍信噪比计)为3.8×10-3～8.4×10-2mg/kg，说明本方法的准确度和精密度较高，重现性好，完全满足农药残留分析的要求。

表1 样品加标回收率及精密度(n=5)

3 结论

本实验研究了L-古洛糖酸-γ-内酯作为分析保护剂对桂皮中有机氯农药残留检测基质效应的作用，相比一般的植物性样品，类似桂皮这种基质复杂、强极性干扰化合物较多的芳香性植物样品，在日常检测活动中若不考虑基质效应，将会影响定量结果的准确性，并对色谱柱和检测器造成污染。本文提出的在标准溶液和净化液中添加适量保护剂的检测方法，对基质增强效应有良好的补偿作用，较好的消除了基质效应对定量结果的影响，大大缩短了检测周期，6种有机氯农药的回收率在95.5%～100.5%之间，方法简便快速，检测周期短，准确性高，重现性好。由于大大减少了有机溶剂的用量，有利于检测人员的身心健康与环境保护，适合制药企业实验室及执法口岸实验室的检测要求，对于其他复杂基质中药材中有机氯农药残留的检测具有较好的借鉴作用。

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