襄阳大头菜腌制液中产膜醭酵母菌的多样性分析

赵慧君，葛东颖，沈 馨，吴 竞，刘 伟，张振东，郭 壮*

（1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北 襄阳 441053；2.襄阳市食品药品检验所，湖北 襄阳 441021）

襄阳大头菜的腌制主要在腌制池或缸中进行，长达18个月的“三腌、五卤、六晒”过程中，有些腌制池或缸表面会形成一层白色的膜醭，导致大头菜的脆度明显降低且产生刺激性气味，使产品品质下降甚至失去经济价值。高需氧的酵母利用食品成分作为培养基生长，在液体表面酵母生长形成膜醭覆盖或漂在产品的表面[1]。VOLLEKOVA A等[2]采用纯培养的方法从红酒的表面生物膜中分离到4株酵母菌；ECHEVERRIGARAY S等[3]从巴西葡萄酒中分离得到了6个种的酵母菌，结果发现其均可以在不同的碳源下形成生物膜；饶瑜等[4]对泡菜生物膜中真菌进行分离，研究表明，Pichia kluyveri和Geotrichum candidum可以导致生物膜的形成。值得一提的是，徐婷等[5]使用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培养基，采用纯培养的方法从长有生物膜的襄阳大头菜卤水中分离了1株酵母菌，并鉴定其为鲁氏酵母菌（Zygosaccharomycesrouxii）。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）基于宏基因组学的研究策略，通过将环境样品中微生物的基因组混合作为一个整体进行研究，不仅揭示了微生物群体的物种组成及丰度信息，亦可以解析物种的生物功能，打破了传统微生物学基于纯培养研究的局限性[6]。目前PCR-DGGE技术广泛应用于红酒[7]、意大利发酵干酪[8]、郫县豆瓣酱[9]、单贝[10]、水果泡菜[11]等很多发酵食品中微生物群落结构的多样性分析。

本研究首先基于PCR-DGGE技术研究了襄阳大头菜正常发酵腌制液与长膜醭腌制液中酵母的多样性，分析可能产膜醭的酵母菌；然后利用纯培养的方法分离、纯化和鉴定膜醭中存在的酵母菌。以期揭示襄阳大头菜腌制液中膜醭的产生与酵母的关系，为襄阳大头菜的工业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

本实验所用材料采集于襄阳孔明菜食品有限公司。分别在6个正常发酵大头菜池和6个长膜醭的大头菜池里采集腌制液和膜醭，采集后4℃保存，带回实验室进行后续试验。

1.1.2 实验试剂

马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基：北京博奥星生物技术有限公司；蛋白胨、酵母提取物：英国OXOID公司；聚丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；D5625-01DNA提取试剂盒：OMEGA公司；DNA Marker：Fermentas公司；PCR清洁试剂盒：美国AXYGEN公司；2×PCR mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq酶、脱氧核糖核苷三磷酸deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。

1.2 仪器与设备

ECLIPSE Ci-L显微镜：日本NiKon公司；VeritiTMDX热循环仪、Nanodrop 2000：美国Thermo Fisher公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System：美国Bio Red公司；Fluor Chem FC3凝胶成像仪：美国Protein Simple公司；Bio 5000plus扫描仪：上海中晶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因组DNA的提取与检测

按照试剂盒上的步骤提取两种大头菜腌制液各6个样品的宏基因组DNA，其中大头菜长膜醭腌制液是将膜醭和腌制液充分混匀后进行DNA提取，提取后用0.8%琼脂糖凝胶进行检测并用Nanodrop 2000分光光度计测定DNA的浓度和质量，将符合实验要求的DNA样品浓度调整一致后放入-20℃保存。

1.3.2 PCR扩增酵母26S rDNA D1/D2区域序列

将提取的宏基因组作为模板进行PCR扩增。正向引物为NL1（F）-GC（5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC CCGCCG CCCCCG CCCCGCGAT ATCAAT AAG CGG AGGAAAAG-3'），反向引物为LS2（5'-ATTCCCAAACAA CTC GAC TC-3'）[12]，PCR扩增体系为2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL NL1（F）-GC（10 mmol/L），0.5 μL LS2（10 mmol/L），0.5 μL rTaq酶（5 U/μL），1 μL DNA模板，18 μL无菌水。PCR反应条件：95 ℃、4 min 预变性，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物5 μL用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 DGGE及数据分析

采用质量浓度为80 g/L的聚丙烯酰胺，变性剂线性梯度为25%～55%的凝胶进行电泳，PCR扩增产物上样量为10 μL（包含10x上样缓冲液）。电泳时，温度为恒温60℃，120V，78min；80V，13h。电泳结束对聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色[13]，显色结束后用扫描仪采集图片，并用Quantity One软件分析图片。

1.3.4 DGGE条带的切割、克隆及测序

切割DGGE胶上的优势条用50 μL无菌水在4℃浸泡过夜后作为模板，用不含GC夹子的引物（NL1和LS2）进行PCR扩增，扩增程序同上。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果并用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行清洁，清洁后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌TOP10中，鉴定阳性克隆并将阳性克隆送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

1.3.5 测序产物的比对及进化树构建

提取测序结果中的目的序列，从GenBank数据库中提取相似度比较高的相似的序列，用MEGA5.0软件制作系统发育树，采用邻接法（neighbor joining，NJ）制作系统进化树[14]，利用Bootstrap（自展法）检测制作的系统树[15]，自展数据集为1 000次。

1.3.6 产膜醭酵母菌的分离与纯化

将襄阳大头菜上的膜醭在超净台中用无菌手术刀刮下后放入无菌水中，进行梯度稀释梯度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度各取0.5 mL的均匀涂布于PDA培养基上，在28℃条件下培养1 d左右。取长出的单菌落后依照形态、颜色和大小等特征选取目的菌株，再划线纯化两次，进行形态观察和镜检，然后将纯化的菌株保存在-80℃冰箱中待用。

1.3.7 产膜醭酵母菌的分子生物学鉴定[16-17]

采用消解酶-氯化苄法提取酵母DNA，以所提取的大头菜酵母菌总的DNA为模板进行分离酵母菌株26S rDNA D1/D2可变区基因的PCR扩增，使用的引物为NL1（5'-GCG ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）。PCR扩增体系为2.5 μL 10×PCRBuffer（含Mg2+），2μLdNTP（2.5mol/L），0.5μLNL1（10mmol/L），0.5 μLNL4（10mmol/L），0.5 μLrTaq（5U/μL），1 μL DNA模板，18 μL无菌水。PCR反应条件：95 ℃、4 min预变性，95℃、1min，58℃、30s，72℃、1min，30个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增结束，取扩增产物5 μL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

将扩增成功的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T vector连接并转化进大肠杆菌TOP10，鉴定阳性克隆并送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。测序后提取酵母菌26S rDNA D1/D2区域基因序列与NCBI上的模式菌株进行比对，并构建进化树，方法同1.3.5。

2 结果与分析

2.1襄阳大头菜不同发酵状态下腌制液样品26S rDNA区域扩增产物DGGE图谱分析

襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭腌制液样品宏基因组DNA提取并检测后，作为模板扩增酵母菌26SrDNA D1/D2区域基因序列，扩增产物大小约为200bp且无特异性扩增，用来进行DGGE。襄阳大头菜不同发酵状态腌制液DGGE图谱见图1。从图1中可以看出，在相同上样量（10μL）的条件下电泳条带的亮度差异很大，特别是条带2和条带5，在襄阳大头菜长膜醭腌制液样品中亮度增加，且长膜醭腌制液的所有条带因为DNA含量高而呈现弥散状态。

图1 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭腌制液的酵母DGGE图谱Fig.1 DGGE analysis of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

2.2 DGGE图谱聚类分析

样品间微生物群落结构的相似性可以由不同样品间共有条带数目的多少来反映。采用UPGMA的方法对襄阳大头菜不同发酵状态腌制液样品间微生物群落结构进行相似性评估，酵母聚类分析见图2。由图2可知，襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭的腌制液被分为了不同的类别。由此推断，酵母菌与大头菜腌制液长膜醭之间存在着一定的关系。

图2 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭腌制液的酵母聚类分析Fig.2 Cluster analysis of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

2.3 DGGE条带测序及同源性分析

对襄阳大头菜不同发酵状态腌制液样品DGGE图谱上的代表性亮带进行切胶、扩增、克隆和测序，与美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上的模式菌株进行比（见表1）对并构建进化树（见图3）。总共对5个条带进行了测序，条带对应图1中的编号。由表1可知，所有条带的序列与NCBI中模式菌的序列的相似性均在99%～100%，说明鉴定具有意义。由图1可知，编号为2和5的条带在长膜醭的襄阳大头菜腌制液中亮度高于正常发酵的腌制液，测序结果为鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii）。

表1 襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭腌制液的细菌DGGE条带比对结果Table 1 Comparison results of DGGE band of bacteria in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

图3 基于26S rDNA D1/D2区域基因序列构建的襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液中酵母系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 region gene sequences of yeast in normal fermentation and Xiangyang mustard root brine with surface film

由测序结果和进化树可以看出，在襄阳大头菜不同发酵状态腌制液中优势酵母菌的种类只有两种，即鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母，且汉逊德巴利酵母的多样性高于鲁氏酵母。

2.4 襄阳大头菜膜醭中酵母菌的分离、纯化与鉴定

以纯培养的方式从襄阳大头菜的膜醭中共分离纯化出8株酵母菌，经测序和与NCBI上模式菌株比对（见表2）和构建进化树（见图4）结果与DGGE测序结果一致，也均为鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母。由此可见，襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜醭腌制液中优势酵母菌的种类相同且种属相对单一。由此推断，襄阳大头菜腌制液在发酵过程中膜醭的形成与鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母的过度繁殖之间存在着必然的联系。

表2 分离菌株的比对结果Table 2 Comparison results of isolated strains

图4 基于26S rDNA D1/D2区域基因序列构建膜醭中酵母系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 region gene sequences of yeast in the surface film

3 结论

本研究基于PCR-DGGE技术结合纯培养的方法研究了襄阳大头菜产膜醭的酵母菌，发现襄阳大头菜正常腌制液与长膜醭腌制液相比，酵母菌的种类相同且单一，均为鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母。鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母在少量存在的时候可以增添食品的风味，大量存在时可以产膜醭。在有膜醭的大头菜腌制液中，鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母的生物量显著增加，因此推断，襄阳大头菜中的膜醭是可能是由于鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母的过度繁殖造成的，后续将对分离的两种酵母进行进一步的研究和验证。

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