修饰壳聚糖包裹的猪IL-2和IL-4/6共表达对小鼠免疫效应的影响

肖永乐 ，杨璐一 *，梁歌 ，万小平 ，罗公民 ，吕学斌 ，王泽洲 ，高荣 **

（1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疾病防控与食品安全重点实验室，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；3.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

近年来，越来越多的细胞因子被用作疫苗的分子佐剂[1]，然其成本高，半衰期短，限制了细胞因子的大规模使用，亟需开发安全和性价比高的免疫调节剂来增强动物的免疫能力。复杂的细胞因子网络限制了单个细胞因子基因在体内的表达活性，加之单基因的生物学活性通常达不到足够的免疫增强效果，为了克服这个限制，我们设计了融合的多个细胞因子基因，使之能够在动物细胞中共表达，加强调节效应，增强动物对感染性疾病的免疫保护能力。这类细胞因子中最常使用的就是白介素分子[2-4]，本研究中我们用2A自剪切短肽连接猪IL-2和IL-4/6，探究其在体外和小鼠体内的免疫协同效应。

1 材料和方法

1.1 重组质粒 真核分泌型表达质粒VR1020，插入融合猪IL-4和IL-6的VRIL4/6以及插入猪IL-2的VRIL2均由本单位实验室构建和保存。

1.2 修饰壳聚糖包裹纳米颗粒的制备及检测 用离子交联法制备质粒DNA壳聚糖纳米颗粒，按文献报道的方法[5]先制备壳聚糖聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰分子（CPP），与质粒按质量比为30∶1的比例在50～55℃水浴磁力搅拌下，将质粒缓慢滴加至材料溶液中，混合均匀，恒温10min，最终得到包裹好的4种纳米颗粒：VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP、VRIL2-CPP、VR1020-CPP。

将纳米颗粒样品进行0.7%琼脂糖凝胶电泳。取1mL纳米颗粒，用Zetasizer 3000 HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径及Zeta电位。

1.3 重组质粒在HEK293细胞中的表达 6孔板中培养HEK293细胞至有80%贴壁时转染4种纳米颗粒，每孔缓慢滴加50μL纳米颗粒，分别于24h、48h和72h收集上清用于检测生物学活性。

1.4 重组质粒的生物学活性检测 用文献报道的方法制备猪淋巴母细胞，96孔板中每孔加入50 μL靶细胞和50μL转染上清液。每个样品设3个重复孔，并设对照孔，置于细胞培养箱中培养48h，然后每孔加入10μL CCK8轻轻吹匀，继续培养2h，用Bio-Reader3550检测每孔OD450（参照OD630）。

1.5 重组质粒在小鼠体内的生物学效应 将40只21日龄（18～22g）健康昆明雌鼠随机分成4组，每组10只，见表1。每只小鼠注射含有100μg重组质粒的纳米颗粒，注射后每周称重并采血。用流式细胞仪测量外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的变化；用ELISA检测血清中的IgG、和IgG1水平；用荧光定量PCR检测血液中免疫相关基因的表达情况。

表1 小鼠分组情况

2 结果

2.1 纳米颗粒的凝胶阻滞实验、粒径及Zeta电位 CPP包裹4种质粒形成的纳米颗粒，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，发现5种纳米颗粒或向正极方向跑，或被阻滞在点样孔中，说明质粒和包裹材料成功地结合在了一起，形成纳米颗粒，并且纳米颗粒分子粒径较小。

4种纳米颗粒的粒径及Zeta电位见表2。从表2可见，所有包裹纳米颗粒的平均粒径在98～154nm之间，Zeta电位在+24.5～+44.7mV之间，说明转染效率较好。

表2 纳米颗粒的粒径和电位

2.2 重组质粒的体外生物学活性 通过CCK8检测细胞成活结果（图1），可见猪淋巴母细胞明显增殖，VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP和 VRIL2-CPP均较对照VR1020-CPP组增殖明显。说明实验质粒用CPP包裹后均能表现出高效的生物学活性，显著刺激猪淋巴细胞增殖（P＜0.05），且 VRIL4/6-2-CPP共表达实验组的效果最佳。

图1 淋巴母细胞增殖情况

2.3 重组质粒在小鼠体内的生物学效应

2.3.1 免疫基因表达定量分析 从免疫相关基因表达水平的定量分析结果（图2）可以看出，实验组IL-1、IL-2、IL-4三种基因的表达量显著高于对照组（P＜0.05）。IL-1和IL-2基因的表达量在7～28d内持续增高并达到峰值，之后逐渐下降，并且VRIL4/6-2-CPP组的表达量略高；IL-4基因的表达量在7～21 d内持续增高并达到峰值，之后逐渐下降；21d之后可以观察到VRIL4/6-2-CPP组的表达量逐渐高于VRIL4/6-CPP 和 VRIL2-CPP组（P＜0.05）。

2.3.2 CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群检测 整体来看（图3），在免疫后21 d内，实验组小鼠血液中的CD4+和CD8+T淋巴细胞含量均较对照组显著升高（P＜0.05）。

2.3.3 血清IgG、IgG1含量测定 如图4所示，实验组小鼠血清中的IgG、IgG1水平均较对照组显著增加（P＜0.05）。IgG含量在0～35d内持续增加，IgG1含量保持平稳，变化不大。

2.3.4 小鼠体重变化 整体来看，注射后0～35d，实验组小鼠的生长速度明显高于对照组小鼠（P＜0.05），见图5。

图2 免疫相关基因表达水平的定量分析

图3 小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例变化

图4 实验小鼠血清IgG、IgG1含量变化

图5 小鼠体重变化

3 讨论

本研究中我们使用2A自剪切短肽连接猪IL-4/6和IL-2基因，获得了一种新型有效的免疫调节分子。2A自剪切技术可使多个基因使用同一个启动子，实现在同一载体中等量表达[6-7]，因此我们在本研究中利用它共表达了3个关键的细胞因子基因，从而增强猪对感染性疾病的免疫能力。体外淋巴母细胞增殖实验证实了融合的VRIL4/6-2可在真核细胞中成功表达出IL-4/6和IL-2，且融合的IL-4/6和IL-2比单独的IL-4/6或IL-2更能促进细胞增殖。整个实验期间，小鼠注射部位无局部炎症发生，在35d的观察期内，实验组小鼠也检测不到系统性的免疫反应症状。

本研究还发现，实验组血清的IgG含量明显增加，且注射VRIL4/6-2的小鼠效果最佳，CD4和CD8分子、IL-2和IL-4基因的表达量也都在注射后不同时间段有所升高。表明注射VRIL4/6-2可加强小鼠的体液免疫、细胞免疫和免疫调节能力。同时，还观察到注射VRIL4/6-2的小鼠比其他组生长更快，与增强免疫的结果保持一致。这些结果有力地证实了CPP包裹的VRIL4/6-2纳米颗粒可有效增强小鼠的生长能力和免疫能力。

本研究证实了VRIL4/6-2能有效增强动物的体液免疫和细胞免疫，可开发成安全有效的免疫增强剂。

[1] Lee A Y，Chung H K，Yong B E，et al.A recombinant human G-CSF/GM-CSF fusion protein from E.coli showing colony stimulating activity on human bone marrow cells[J].Biotechnology Letters，2003，25（3）：205-211.

[2] Zhang H，Cheng C，Zheng M，et al.Enhancement of immunity to an Escherichia coli vaccine in mice orally inoculated with a fusion gene encoding porcine interleukin 4 and 6[J].Vaccine，2007，25（41）：7094-7101.

[3]Kim J J，Yang J S，Montaner L，et al.Co-immunization with IFN-gamma or IL-2，but not IL-13 or IL-4 cDNA can enhance Th1-type DNA vaccine-induced immune responses in vivo[J].Journal of Interferon and Cytokine Research，2000，20（3）：311-319.

[4]Yang X，Sun WK，Chen WL，et al.Promotion of the immunity of piglets to Hog cholera vaccine induced by shuffled pig interleukin-2 gene and CpG immunostimulatory sequences encapsulated in chitosan nanoparticles[J].Procedia in Vaccinology，2010，2（1）：51-59.

[5] Xu Z，Wan X，Zhang W，et al.Synthesis of biodegradable polycationic methoxy poly（ethylene glycol）-polyethylenimine-chitosan and its potential as gene carrier[J].Carbohydrate Polymers，2009，78（1）：46-53.

[6] Felipe P D，Ryan M D.Targeting of proteins derived from self-processing polyproteins containing multiple signal sequences[J].Traffic，2004，5（8）：616-626.

[7] Szymczak AL，Vignali DA.Development of 2A pept-ide-based strategies in the design of multicistronic vectors[J].Expert Opinion on Biological Therapy，2005，5（5）：627.