霜霉病菌诱导大白菜微管蛋白基因表达研究

陈晓峰 王承国 隋好林 牟晋华

摘要：本试验主要研究大白菜α-微管蛋白基因受霜霉病菌诱导的表达特点以及病原菌侵染下微管动态结构变化。结果表明，霜霉病菌诱导后，大白菜抗、感病品种中两种α-微管蛋白基因均呈现诱导表达特点，且抗病品种叶片细胞微管结构较为完整。说明微管骨架在植物对抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

关键词：霜霉病菌；微管；α-微管蛋白；微管骨架

中图分类号：S634.1+Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0009-03

Abstract This paper mainly studied the expression characteristics of the α-tubulin protein gene induced by Peronospora parasitica and the dynamic structural changes of the microtubule under the infection of Peronospora parasitica. The results showed that α-tubulin protein genes expressed in all materials after Peronospora parasitica induction， and the microtubule cytoskeleton was more complete in the resistant variety. It indicated that the microtubule cytoskeleton had a certain function in plant against fungal pathogens.

Keywords Peronospora parasitica； Microtubule； α-tubulin； Microtubule cytoskeleton

微管是真核生物细胞的重要组成部分，在细胞形态发生、信号识别、细胞极性的建立等方面起着至关重要的作用[1，2]。在植物生长发育过程中，微管蛋白可以调节植物细胞以不同的形态来适应环境和功能的需求，同时对植物纤维素和木质素合成、构建完整细胞骨架均具有重要作用[3]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族组成[2，4-7]。通过对α-微管蛋白基因家族研究发现，该基因家族具有保守性，其在结构上非常相似，但在植物诱导表达和组织特异性表达上不尽相同[2，4]。

近几年，关于微管骨架在植物抗性中的作用越来越受到重视，研究人员对其在改变植物生化特性、诱导植物产生过敏性坏死反应（hypersensitive response，HR）等一系列抗性反應以及微管骨架参与植物和病原菌互作中的作用进行了研究[8-12]。研究发现，不同病原菌的侵染对微管骨架的结构影响不完全相同，可见微管骨架在植物抗性反应中的作用尚有需要明确的地方。而关于微管骨架在植物与病原菌互作中的动态变化，其调控因子以及在信号传导中的作用等，仍然是未来研究的重点[13-16]。

本试验对霜霉病菌诱导大白菜微管蛋白基因表达以及微管骨架受病原菌侵染在不同抗性材料中的动态结构变化进行了研究，以期了解细胞骨架在作物抗性反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

霜霉病菌、大白菜抗病品种“新烟杂3号”（XYZ-3）和感病品种“包头莲”（BTL）由中国农业大学烟台研究院提供。大白菜种子消毒后，在人工气候箱内培养，待幼苗长至2～4片叶时用于试验。

免疫荧光观测所用果胶酶和纤维素酶、微管标记抗体均采用Sigma公司产品。

1.2 真菌接种液的制备和接种程序

霜霉病菌（Peronospora parasitica）接种液的制备和接种参照陈晓峰等[17]的方法，最终配成1×106个/mL孢子囊悬浮接种液。处理组每个单株叶片喷涂病原菌诱导液，对照组用纯水代替。诱导处理后植株需遮光、保湿处理24 h，然后揭掉遮光物，于人工气候箱内20～25℃、12 h/12 h光周期、相对湿度（85±5）%条件下培养，直至采样结束，每处理重复3次。

1.3 荧光定量PCR检测P. parasitica诱导α-微管蛋白基因表达

1.3.1 引物设计 在GenBank大白菜数据库中选取所需要的α-微管蛋白基因（Bra002261和Bra006517），引物设计参考文献[2]，以大白菜肌动蛋白actin基因为内标基因，序列见表1。

1.3.2 荧光定量PCR反应体系和反应程序 提取处理和对照0、12、24、36、48、72、96 h大白菜叶片RNA，利用反转录酶将mRNA合成为cDNA。荧光定量PCR反应体系和反应程序参考陈晓峰等[17]的方法，每处理重复3次。

1.4 大白菜叶片细胞微管间接免疫荧光检测

霜霉病菌诱导接种36 h后采集抗、感病大白菜植株叶片，参考张静宜等[18]的方法进行微管免疫荧光观测。

2 结果与分析

2.1 P. parasitica诱导α-微管蛋白基因表达分析

从图1可以看出，两个微管蛋白基因均呈现先上升后下降的表达特点，在抗病品种中，两个基因表达量均高于感病品种，经霜霉病菌诱导12 h后表达量增加，诱导36 h均达到峰值，后逐渐下降；感病品种中，Bra006517基因表达变化趋势与抗病品种中类似，Bra002261稍有不同，诱导12 h时表达量快速升高，诱导48 h后表达量明显下降，72 h后恢复到起始表达量。

2.2 间接免疫荧光观测大白菜叶片微管结构差异

从图2可以看出，病原菌诱导36 h后，抗、感病大白菜品种叶片中微管显微结构观测结果不尽相同，抗病品种XYZ-3叶片细胞中围绕细胞核周围微管骨架结构较为完整，感病品种BTL细胞周围微管骨架结构出现分散现象。

3 讨论

目前，关于微管骨架与植物抗病性关系的研究主要集中在寄主过敏性坏死反应（HR）和过氧化氢累积方面。通过物理和化学因素诱导微管解聚，会降低植物过敏性坏死细胞的产生，导致植物对病原菌侵害抗性降低[2， 8-12，19]。通过对病原菌侵染植物组织进行免疫荧光观测，发现微管骨架聚集于侵染点或接种点周围[13-15]，说明微管蛋白基因表达量增加直接或者间接参与了植物的抗性反应。

微管骨架广泛存在于植物细胞结构中，α-微管蛋白同分异构体在细胞和特定组织存在空间和时间表达上的差异[2]。本研究中的两种α-微管蛋白已被证实受紫杉醇、赤霉素（GA3）等化学物质诱导表达[2]。本研究中我们对霜霉病菌侵染后抗、感病大白菜品种中α-微管蛋白基因表达量进行了分析，发现两个α-微管蛋白基因受P. parasitica诱导表达，抗病品种中微管蛋白基因表达量略高于感病品种，说明微管蛋白基因可能参与植物应对真菌病原菌侵染的抗性反应。通过对叶片细胞中微管骨架的免疫荧光检测，发现抗病品种叶片细胞中微管骨架结构比较完整，而感病品种细胞微管骨架结构出现变化，这些都证明细胞骨架在真菌病原菌与寄主之间的抗性反应存在一定的联系。

下一步需要着重研究整个微管基因家族的诱导表达特性，以及微管蛋白表达量高底是否与植物细胞骨架的结构变化有一定的关联性，同时完善病原菌诱导植物细胞微管骨架的动态研究。

参 考 文 献：

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