磁性PLGA-NdFeB- Fe3O4原位植入物热消融治疗裸鼠乳腺癌

唐秀珍,王龙辰,高 维,胡 兵,王志刚,郑元义1,*

(1.重庆医科大学超声影像学研究所,重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院超声科，重庆 400010；3.上海交通大学附属第六人民医院超声科，上海 200233；4.上海超声医学研究所，上海 200233)

磁感应加热是一种新型的微创治疗技术[1-2]，可利用磁性材料在交变电流感应线圈中将电磁能转变为热能，从而杀伤肿瘤细胞，且因不受肿瘤深度的限制而优于其他微创技术如射频消融、微波消融等[3-5]，目前已被广泛应用于临床[6-8]。本研究制备一种新型载钕铁硼(NdFeB)和 Fe3O4液固相变型聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)原位植入物(PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4)，观察其在高频交变磁场下间隔加热的产热情况、在体外的磁性大小及对裸鼠MDA-MB-231乳腺癌治疗效果，以期为治疗深部肿瘤提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备 Fe3O4粒子(直径20～50 nm；成都艾科化学试剂有限公司)，PLGA(50∶50，40 000 Da；济南岱罡生物科技有限公司)，N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone，NMP，Sigma)，NdFeB(广州新诺德公司，400目)，声诺维(Bracco)，多聚甲醛、胎牛血清、DMEM(Gibco)，Siemens S2000超声诊断仪，红外热成像仪(Fotric)；自制超高频电磁感应加热仪(频率513 kHz，输出功率8 kW，线圈直径 10 cm，线圈匝数4)，充磁机(上海格磁电科技公司ME-2540D)，磁力测量计(HT108毫特斯拉计)，扫描电镜(日本JEOL)。MDA-MB-231人乳腺癌细胞(中国科学院细胞库)， 4～6周雌性裸鼠10只(上海市第六人民医院动物实验中心)。

1.2 PLGA-60%NdFeB-20% Fe3O4的制备及表征 以PLGA∶NMP为2.2 g∶4 ml的比例[9]配置PLGA/NMP凝胶，最终按照 Fe3O4、NdFeB、PLGA、NMP的质量分数分别为10.00%、60.00%、10.56%和19.54%配置样品。取7天后形成的固体断面，于扫描电镜下观察其内部形态特征。

1.3 测量磁性大小 按照上述比例制备体积为60 μl的PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4凝胶，待其凝固干燥后充磁(2.5 kV)，分析PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4在水中凝固1～6 h的磁性大小。另分别配置60、80、100 μl的PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4，凝固4 h后测量磁性大小。

图1 PLGA-NdFeB- Fe3O4凝胶的表征 A.大体表现; B、C.扫描电镜下呈疏松多孔结构(B，×10 000； C，×15 000)

1.4 测量离心管内加热效率 制备60 μl PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4，凝固后放入含1.5 ml双蒸水的离心管内。将离心管置于线圈内，先连续加热2 min，暂停40 s再加热10 s，重复最后两个步骤，共用时10 min。利用红外仪监测加热过程中PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4的变化，以AnalyzIR软件进行分析。

1.5 离体牛肝加热实验 选取4块2 cm×2 cm×2 cm新鲜牛肝块。用注射器将PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4凝胶注入牛肝块中心，静置4 h待其凝固后进行加热。分别于加热1、2、3、4 min后切开牛肝块，测量消融体积。

1.6 建立肿瘤细胞培养和移植瘤模型 于37℃、含5% CO2的孵箱中，采用含DMEM、10%胎牛血清和1%抗生素的培养液培养裸鼠MDA-MB-231乳腺癌细胞。约48 h后，待细胞在培养瓶中长满时，于裸鼠右侧臀部皮下注射200 μl肿瘤细胞悬液(2×106个)，之后20天左右待肿瘤体积长至约1 cm3时进行实验。

1.7 活体动物加热实验及CEUS 将10只成瘤裸鼠均分为加热组和对照组。麻醉裸鼠后(1%戊巴比妥钠，0.12 ml/只)于超声引导下向瘤内注射60 μl PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4，对加热组裸鼠先加热5 min，然后经尾静脉注入100 μl声诺维溶液，再加热5 min，采用超声观察裸鼠瘤内的血流灌注情况。第2天两组各处死1只裸鼠，剖取新鲜瘤块，以4%多聚甲醛溶液固定，行HE染色。此后20天连续观察记录两组剩余裸鼠的活动状态、体质量和肿瘤体积。

2 结果

2.1 PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4凝胶的表征(图1) 肉眼观察PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4凝胶呈不透明黑色胶体，扫描电镜下呈疏松的海绵状结构，内部结构多孔。

2.2 磁性大小测量 制备出的PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4呈凝胶状，在水中逐渐变硬，干燥充磁后可吸引周围铁粉而形成磁力线(图2)。磁性大小随固化的时间而增强，后趋于减少，在固化后3 h时充磁，此时磁性达最大(图3)。PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4不同时间点的磁性大小见图3。体积为60、80、100 μl的PLGA-NdFeB- Fe3O4磁性大小分别为(865.33±33.72)Gs、(1 000.00±97.11)Gs、 (1 073.00±124.23)Gs。

2.3 试管内加热效率 对60 μl PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4进行加热，温度随时间增加而上升，120 s时达(59.27±3.45)℃(图4)。暂停加热40 s时，温度快速降低，重新加热10 s后温度再次上升。重复以上步骤可使温度稳定在55℃～65℃。

图2 PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4磁性评估 A.充磁后放在均匀铺满的铁粉中心，可吸引周围铁粉; B.放在有均匀铁粉的纸片下方，可吸引铁粉形成磁力线 图3 磁性大小的定量评估 60 μl PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4在水中固化不同时间点的磁性大小

2.4 离体牛肝加热实验 随时间延长，离体牛肝消融范围逐渐扩大，消融组织呈白色，PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4呈黑色(图5)。离体牛肝消融范围随消融时间延长而增大，1、2、3、4 min消融体积分别为(0.17±0.16)cm3、(0.93±0.25)cm3、(2.34±0.25)cm3和(4.10±0.26)cm3。

2.5 肿瘤治疗结果及CEUS 肉眼观察，治疗组裸鼠在间隔加热3 min时肿瘤皮肤表面变白，第2天肿瘤皮肤表面有红色液体渗出，结痂、脱落，经20天创面逐渐愈合，肿瘤消失，裸鼠活动和体质量均未见明显变化。对照组肿瘤体积则逐渐变大。未注射PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4时，CEUS显示移植瘤内造影剂迅速从瘤体中心向周围充填(图6)，约15 min后逐渐消退。注射PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4后，瘤体内部充盈缺损，但肿瘤边缘有造影剂充填，磁热治疗后几无造影剂显影。HE结果证实，治疗组肿瘤细胞核碎裂、消失，胞质呈嗜酸性染色，但组织结构轮廓存在，呈凝固性坏死。

图4 60 μl PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4在离心管内的加热效率 A.加热前的红外仪图片； B.加热120 s时红外仪图片； C.时间温度曲线，灰色区域为加热区，白色为暂停加热区，虚线为标准差 图5 离体牛肝消融效果评估 分别为间隔加热1 min(A)、2 min(B)、3 min(C)、4 min(D)时的牛肝组织剖面标本，可见消融的牛肝组织呈白色

图6裸鼠磁热治疗效果观察 A～C.为造影模式下裸鼠在注射前(A)、注射后(B)及磁热治疗后(C)的图像PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4呈高回声(箭)； D、E.分别为对照组(D)和治疗组(E)裸鼠的消融后肿瘤组织的HE染色结果(×200)

3 讨论

液固相变型PLGA原位形成植入剂目前主要用于释放化疗药物[10]，但单一化疗难以对肿瘤达到最佳治疗效果。磁热消融可在实现肿瘤区精确定位热疗的同时有效杀死肿瘤细胞，并激发机体免疫系统。近年来，研究[11-13]表明化疗与消融治疗间存在较强的协同作用，使联合应用化疗和消融技术成为治疗肿瘤的新方向。

本研究预实验结果表明，NdFeB含量越高，材料的磁性越大，但为实现微创治疗肿瘤的目的，需在保证可注射性良好的前提下增加NdFeB的质量分数。肿瘤细胞坏死所需温度应≥43℃[11，14-15]，但前期实验[16]发现试管内加热时，如温度超过90℃，PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4将完全溃散，未能消融肿瘤边缘的细胞，易形成残余瘤。本实验采取间断加热方式，既可保证治疗肿瘤所需温度，又能避免过高温度带来的不利后果。本研究牛肝加热实验结果提示，随时间延长，消融体积逐渐增大，加热4 min时消融体积较大，可能导致烧伤周围正常组织，因此在后续实验中将在体消融肿瘤时间设定为3 min。

本研究在液固相变型PLGA-Fe3O4原位形成植入物[17-19]的基础上增加NdFeB，不仅可保持加热效果[16]，还可形成一种新的药物磁靶向通路。然而PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4充磁后虽然具有磁性，但形成的磁力大小分布杂乱无规则，材料表面磁性高低不均，分布无规律，理论上吸引周围磁性纳米粒的力也不相同，易导致肿瘤内部的纳米粒分布不均匀而形成残余瘤。本研究在间隔加热时通过开关磁场控制磁力，既可使加热温度维持在消融的有效范围内，又不会造成过高温度。

总之，本实验发现PLGA-60% NdFeB-20% Fe3O4原位植入物在高频交变磁场作用下可产生明显热效应，间隔加热下可有效在体消融裸鼠MDA-MB-231乳腺癌。但本实验仅采用单一磁热治疗，未能观察联合治疗产生的协同作用；同时，NdFeB为新型生物材料，相关磁性纳米载体的临床应用以及纳米材料毒理学研究均有待深入开展。

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