溶氧和无机盐控制对L-色氨酸发酵的影响

◎ 陈立平，朱传广，孙海东

（1.吉林大学动物科学学院，吉林 长春 130000；2.长春大成实业集团有限公司，吉林 长春 130000）

L-色氨酸是人体和动物生命活动所必需的8种氨基酸之一，以游离态或结合态存在于生物体中[1]，广泛应用于食品、医药和饲料等方面。在生物体的生长发育与新陈代谢中扮演着举足轻重的角色。早期，多采用化学合成法[2]和蛋白质水解法[3]来实现色氨酸的工业生产制备，但存在原料昂贵、转化率低等问题，因而未能实现大规模推广。

目前，在工业生产中，主要采用微生物发酵法来制备L-色氨酸[4-5]，此外还以葡萄糖、甘蔗糖蜜为原料，再通过优良的色氨酸菌株诱导生成色氨酸的方法，这种方法被称为直接发酵法。由于无法直接从自然界获取色氨酸，且其合成途径工艺复杂，因此可以利用诱变或基因重组的方法获得色氨酸。在实验过程中，由于发酵过程中其他酸的影响，使色氨酸的合成受到抑制，因此，抑制其他酸的产生，使之向合成色氨酸途径发展，对大生产有重大意义。

大肠杆菌被大量应用于微生物发酵领域[6]，这主要归功于大肠杆菌易于培养、发酵周期短的特点，更重要的是大肠杆菌的遗传背景清晰，便于诱变过程中对基因的改造。本文在溶氧20%～30%的环境条件下，针对大肠杆菌进行不同浓度无机盐的培养试验、观察、记录，从而得到产量最优的色氨酸菌株。

1　材料与方法

1.1　菌种

大肠杆菌E.coliDJ-4322，由大成集团氨基酸菌种实验室提供。

1.2　仪器

生物显微镜（奥林巴斯公司）、TDL-80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）、双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）、722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、3L自动控制发酵罐（德国）、电子台秤[梅特勒-托利（常州）测量有限公司]、SBA-40D生物传感分析仪（山东科学院生物研究所）。

1.3　基础培养基及培养方法

1.3.1种子罐培养基

葡萄糖 20.0 g/L、(NH4)2SO410.0 g/L、MgSO4·7H2O 5.0 g/L、FeSO4·7H2O 15.0 g/L、KH2PO41.5 g/L、MnSO4·H2O 1 g/L、酵母浸粉15.0 g/L、柠檬酸钠0.5 g/L、维生素B1100 mg、121 ℃灭菌20 min。

1.3.2培养方法

经菌种室预培养的菌种接入上述培养基中，转速为400～800 r/min，温度控制在35 ℃，通过自动补充氨气使pH保持在6.9，培养15 h后将接入发酵大罐。

1.3.3基础培养基

KH2PO47.5 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、(NH4)2SO41.6 g/L、柠檬酸钠2 g/L、葡萄糖7.5 g/L、微量元素液2 mL/L，121 ℃灭菌 15 min。

微量元素液：CoCl2·H2O 0.75g/L、CuSO4·5H2O 2.5 g/L、FeSO4·7H2O25 g/L、甜菜碱0.4 g/L、酵母浸粉1 g/L，pH6.7～6.9。121 ℃灭菌15 min。

1.3.4培养方法

取上述种子发酵液的10%菌体接入3 L发酵罐中，空气量1 L/min，转速800～1 000 r/min，培养温度35 ℃，自动补充氨气，pH控制在6.8，随着菌体生长而初糖耗尽时，向罐体内流加葡萄糖，慢慢调控使溶氧在20%～30%。

1.4　测定方法

1.4.1酸浓度测定

（1）L-色氨酸的测定方法。首先将发酵液置于离心机中以3 000 r/min的速度离心10 min，随后稀释到适当的倍数，称取1 mL稀释过的发酵液和9 mL的对二甲氨基苯甲醛储备溶液，将两者混合并移入试管，60 ℃水浴15 min，然后在溶液中滴入0.05 mL的0.5%亚硝酸钠溶液，混合均匀之后再在60 ℃的水浴环境条件下静置5 min，完毕之后取出冷却，静置10 min。采用硫酸溶液（不含对二甲氨基苯甲醛显色剂）作为样品空白，在593 nm处用1 cm比色皿测定吸光值。利用L-色氨酸标准溶液进行系列溶液的配制，以相同的方法获得标准曲线，从而定量求出L-色氨酸的产量。

（2）纸板层析法。将层析板根据实验样品数裁出合适的宽度，在距离底边2～3 cm处用铅笔划出一条直线，在直线上根据样品数点上已稀释好的样品，吹干后放入自制的展开剂中走样，行至析板顶部后取出放入烘箱中，5 min后取出，根据显色斑点深浅与标样对比计数。展开的时间不能过长，否则烘干的样点会模糊不清。

1.4.2pH测定

线上测定和线下校正。

1.4.3溶氧测定

采用溶氧和光氧电极混合测定。

1.4.4菌液浓度测定

波长设定为600 nm，稀释后的菌液放入722可见分光光度计中测数。

1.4.5葡萄糖浓度的测定

将葡萄糖用蒸馏水稀释一定浓度后，采用生物传感分析仪进行测定。

2　结果与分析

2.1　溶氧控制对菌液浓度、乙酸抑制和L-色氨酸合成的影响

氨基酸生产菌是一种需氧菌，需要在无菌空气条件下才能进行生物体的繁殖以及所需代谢产物的积累[7]，因此，合理地设置发酵液中溶氧浓度参数[8]将成为氨基酸发酵工艺中的重要因素，并且适当的供氧量可以降低制作成本，节约能源[9]。

更重要的是，发酵液中的溶氧量会影响菌体的生长和代谢产物的积累，从而影响最终的产量[10]，这是因为微生物酶的活性及代谢途径会随着溶氧浓度的变化而发生一定的变化。因此，在微生物的发酵过程中，溶氧量对菌体的生长有很大的影响，且溶氧的控制不是一成不变的，本实验是控制不同的溶氧来观察菌体的生长情况。

每组实验均采用6个3 L发酵罐，每2个为平行样，最终取平均值，记录对实验的影响。在发酵培养过程中，保证培养基、培养条件、接种量相同，通过改变通氧量来观察实验效果。在实验初糖耗尽后，开始流加浓糖，使溶氧分别控制在10%～20%、20%～30%、30%～40%，来记录对菌液浓度和酸的影响。如图1所示，为当溶氧控制在10%～20%时，溶氧过低，L-色氨酸生产途径受到抑制，乙酸大量生成，至使菌体浓度在短时间内降低，色氨酸也不断下降。当溶氧控制在30%～40%时，虽乙酸积累不是很多，但会产生很多色素，使色氨酸停止合成而降低，虽然菌体浓度较高，但是没有最终合成产物。当溶氧控制在20%～30%时，乙酸产量最少且色氨酸产量较高，因此20%～30%的溶氧范围为最佳的实验条件。

图1　不同溶氧浓度对生产菌体浓度、乙酸和L-色氨酸产量的影响图

2.2　无机盐浓度对菌体浓度、乙酸产量和L-色氨酸产量的影响

在实验过程中，经常发现当色氨酸达到一定产量时，色氨酸的积累就会停滞或下降，此过程大大增加了控制的复杂性及成本支出，即使达到最高值，各实验最终色氨酸产量也都相近。保持葡萄糖流加并控制溶氧在20%～30%状态，且其他控制参数不变，经反复实验发现，此菌种通过改变无机盐浓度会使产量有所改变。无机盐虽用量不大，但如果在合成色氨酸过程中无机盐的补充跟不上，就会影响产量。因此，通过实验不同无机盐浓度来实现色氨酸产量的提高。在基础培养基基础上进行调整，将无机盐七水硫酸锌分别调为基础的1.17倍、0.79倍、0.40倍，一水硫酸锰调整为原来的1.13倍。结果如图2所示，随着无机盐浓度的调整，色氨酸的产量发生了很大变化，当浓度调整到0.40倍时，酸的产量达到一定程度后不再产酸，之后反而下降，当浓度达到1.17倍时，产量有所增加，但当降到0.79倍时，乙酸产量最低，且色氨酸量会达到最高，所以采用原来培养基的0.79倍进行实验。

图2　不同无机盐浓度对菌体浓度、L-色氨酸和乙酸的产量的影响图

3　结果与讨论

（1）色氨酸初始发酵时，菌体处于起步生长阶段，对氧的需求并不是很大，但随着发酵的不断进行，菌体生长加快，繁殖加速，耗氧不断增加，此时应及时调整通氧量，保持菌体的正常需求。当菌体生长到一定阶段时，应保持通氧量为20%～30%状态，过高或过低都不利于菌体的生长。有文献[11]表明，过高的溶氧水平会使菌体发酵过程中产生新生氧，其分离出的O2-和OH-将对细胞的组分进行一定的破坏，并且会消耗大量的能量，产生许多泡沫。虽然不会积累大量的乙酸，但会形成较多的色素，使色氨酸合成停止，糖酸转化率降低。若溶氧过低，发酵菌体生长繁殖会受到抑制，菌种提前老化甚至自溶，还可生成许多代谢副产物，如乙酸的大量积累，在很短时间内菌体浓度降低，色氨酸产量下降。

（2）发酵菌体虽然无机盐量需要不是很多，但是无机盐用量的多少却影响着菌体的生长和代谢产物的形成，对实验有至关重要的作用。加入高无机盐会使乙酸的合成延后，如图2中所示，当无机盐量提到原来的1.17倍时，乙酸合成稍有延后，但很快就会加速合成。从而抑制L-色氨酸的合成，降低酸的产量。当无机盐过低时，当达到原来的0.40倍时，乙酸的量加速合成，同样达不到目的。因此，合理控制无机盐的量有利于色氨酸的合成。

上述实验是无机盐的部分组合实验，接下来将继续研究各个不同无机盐对产酸的影响，以便找到更优的无机盐浓度，达到更高的色氨酸产量。

（3）目前，国外生产L-色氨酸的企业也只有少数几家，大多集中在欧美等国家，且由于每年L-色氨酸需求量不断增加，但L-色氨酸的产量却没有增加，我国由于受到技术的限制，生产能力不及国外，多依赖于国外进口。

L-色氨酸具有较大市场潜能，随着人们对L-色氨酸的重视，不仅将其应用于医药、饲料和食品，还将应用于化妆品等。目前国内由于生产色氨酸的技术工艺复杂且成本较高[12]，因而只有少数厂家能进行色氨酸的生产，这将导致色氨酸产量较低，因此需要更多的研发人员致力于L-色氨酸的生产研究，不断完善其生产工艺，为我国的L-色氨酸生产打开更广阔的领域。