外加电子供体强化四环素在光催化-生物降解直接耦合反应器中的降解

马 跃，王 越，赵治权，熊厚锋

(1.吉林大学环境与资源学院，吉林 长春 130012； 2.东北师范大学环境学院，吉林 长春 130117；3.九江学院化学与环境工程学院，江西 九江 332005)

目前，抗生素滥用导致的抗性基因传播、生态系统失衡已引起了人们的关注[1-3].其中，四环素类抗生素是应用最为广泛的控制疾病和促进动物生长的典型抗生素之一，[4]因此四环素类废水的处理就成为了一个亟待解决的问题.目前被广泛采用的高级氧化技术存在处理费用高、矿化不完全的问题.此外，由于抗生素具有杀菌、抑菌的特性，生物法不能单独完成抗生素废水的处理，因此工程上广泛采用高级氧化法和生物降解联合工艺进行抗生素废水的处理，其中抗生素的氧化程度是该工艺高效、低耗的关键调控因子.光催化氧化-生物降解直接耦合技术(ICPB)与上述传统工艺相比，对抗生素废水处理具有潜在优势.ICPB体系中，可生物降解的光催化中间产物能够被微生物直接利用，避免了过度氧化并提高了矿化效率[5].

ICPB体系已经成功应用于苯酚[6]、三氯苯酚[7-9]、二硝基甲苯[10]和染料[11]的降解，显示了ICPB对难生物降解有机污染物的处理优势，后续又在ICPB的基础上引入了可见光技术，建立了可见光诱导的光催化-生物降解直接耦合体系(VPCB)，弥补了以往只能使用紫外光的不足[12].在应用VPCB时，载体内部生物膜对光催化产生中间产物的降解对提高处理效果起到了至关重要的作用.尤其是在处理抗生素类对生物抑制性较大的污染物时，如何保持生物的活性并维持其正常代谢功能是VPCB的难点和关键.解决该问题的一个可能的策略是提供易生物降解的底物(如醋酸钠)，提供额外的代谢电子加速氧化反应并通过提供碳源促进微生物的代谢活性[13]从而优化生物群落结构，促进污染物的降解和化学需氧量(COD)的去除.

本研究通过对比VPCB反应器中有无醋酸钠电子供体时盐酸四环素(TCH)的降解情况、生物膜的存活及光催化中间产物的利用情况，考察了外加电子供体对VPCB降解TCH的影响，以为抗生素类废水的高效降解提供新的思路.

1 实验设计

1.1 药品与试剂

盐酸四环素(TCH，98%，Sigma-Aldrich Co.Ltd，USA)；醋酸钠(98%，北京化工厂).TCH模拟废水的成分包括TCH(30 mg/L，VPCB-1)或TCH(30 mg/L)和外加电子供体醋酸钠(255 mg/L，VPCB-2).NH4Cl和Na2HPO4·12H2O(98%，北京化工厂)分别作为氮源和磷源，添加量按m(COD)∶m(N)∶m(P)=100∶5∶1来计算.

1.2 催化剂的制备与负载

将2 mmol AgNO3与500 mL 4.0 mmol/L的柠檬酸钠溶液在密封的顶空瓶中混合并连续搅拌，温度逐渐升高到80℃，直至溶液由无色变为棕黑色；逐滴滴加1 mol钛酸异丙酯和0.15 mol HNO3的混合液，不断搅拌；滴加完成后在50℃的水浴锅中持续搅拌24 h，所得溶液放入高压反应釜中130℃水热5 h，得到Ag/TiO2溶胶[14].将制备的Ag/TiO2溶胶负载于尺寸为2 mm×2 mm×2 mm、孔径100～300 μm、孔隙率87%的聚氨酯海绵载体(江苏哈宜戴沃思生物技术有限公司)上.

1.3 接种与生物膜培养

将载体浸入活性污泥(取自长春市南郊污水处理厂)中24 h以吸附微生物，之后将生物膜在内循环流化床中曝气培养，以醋酸钠作为碳源.

1.4 反应装置

反应装置为540 mL的有机玻璃光催化内循环生物反应器(见图1)，由内外两个空心圆柱环型构成.通过35 W曝气泵(潍坊SOBO)向反应器的内部回路供应空气，流速为10.6 mL/s.实验所用的可见光光源为LED面板灯(42 W，广东Hueler).

图1 光催化-生物降解直接耦合(VPCB)反应器示意图

1.5 分析项目与方法

TCH浓度的测定采用超高效液相色谱(UPLC，美国Waters)，色谱柱为2.1 mm×50 mm×1.7 μm的BEH C18 色谱柱 (美国Waters)，以乙腈(10%)和0.1%的甲酸(90%)为流动相，流速为0.5 mL/min，进样量20 μL，紫外检测器波长设置为357 nm.

生物膜上的活、死菌细胞分布通过激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)观察分析得到.采用染色细菌细胞活性测定试剂盒(L-7012，LIVE/DEAD©BacLight TM，Molecular Probes公司，美国)对细菌进行染色.

利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察载体表面和内部催化剂、生物膜结构及其分布情况.首先配置0.1 mol/L的磷酸盐缓冲盐(phosphate buffer solution，PBS，pH=7.2)和2.5%的戊二醛固定液.从反应器中取出海绵载体，用PBS溶液清洗后用戊二醛固定液固定；使用冷冻切片包埋剂(Tissue-Tek O.C.T，SAKURA，美国)包埋后进行冷冻切片，切片后的样品用载玻片(覆盖多聚赖氨酸)收集；接着用PBS溶液漂洗，并依次使用锇酸(1%)和多聚甲醛(4%)固定，固定好后用PBS漂洗；然后用5个梯度的乙醇溶液进行脱水处理，最后用无水乙醇脱水.脱水后的样品用丙酮置换后可以进行喷金镀膜处理.

不同反应条件下载体生物膜中生物群落结构的变化采用高通量宏基因组分类测序技术进行检测.

2 结果和讨论

2.1 直接耦合体系的构建

通过载体内部和外部电镜扫描图片证实了VPCB体系的成功构建.挂膜培养后，载体内部和外表面都覆盖了厚厚的生物膜(初始)，在VPCB中反应8 h后，载体外表面的生物膜大部分脱落(VPCB-1，表面)，催化剂暴露出来，而载体内部的生物膜保存下来(VPCB-1，内部)，形成了理想的直接耦合复合载体.添加外加电子供体醋酸钠后，载体外表面的生物膜脱落(VPCB-2，表面)，而载体内部(VPCB-2，内部)的生物膜比VPCB-1(无醋酸钠)中的生物膜更加致密、饱满，表明加入醋酸钠可以提高微生物的活性(见图2).

图2 有无外加醋酸钠时海绵载体内部和外表面SEM图像

2.2 VPCB对TCH的降解

图3A为6个运行周期内VPCB-2对TCH的降解情况.添加醋酸钠后，在6个周期内VPCB-2对TCH的去除效率稳定在80%左右.为了确定醋酸钠在TCH降解中的作用，将VPCB-2与VPCB-1在一个典型的周期中进行TCH降解的准一级动力学拟合情况进行比较，结果见图3B.其中，AD-2和AD-1分别为有、无电子供体时海绵载体对TCH的吸附作用.吸附体系在第1小时(约15%去除率)内快速吸附，随后是持续至第12小时的缓慢状态，AD-1和AD-2对TCH的去吸附率仅为31.1%和21.3%.而直接耦合显著提高了TCH的去除率，VCPB-1和VCPB-2在1 h时分别降解了36.2%和61.3%，在12 h时分别达到79.4%和86.1%.VPCB-1和VPCB-2对TCH的降解率常数(k)分别为0.10和0.14，表明加入醋酸钠后，TCH的降解速度提高了40%，TCH的去除效率提高了8%.

图3 外加醋酸钠运行6个周期TCH降解图及稳定周期降解动力学拟合图

2.3 微生物活性

图4为有无外加醋酸钠时海绵载体上生物膜活、死菌染色的激光共聚焦显微镜图.在没有外加碳源的情况下，VPCB-1中的生物膜生物活性较低，载体中活菌(绿色)的比例从未开始反应前的90%下降到57%，这与TCH对生物的毒害作用有关；而添加醋酸钠之后，VPCB-2中载体上的生物膜活性较好，到第8小时，活菌和死菌(红色)的比例为86%和14%，基本维持在挂膜后未反应前的水平.作为最简单的碳源，醋酸钠很容易被生物利用，促进生物的生长[15]，同时它也能作为微生物生长的能源[16-17].当环境中存在不利因素如TCH时，醋酸钠的存在能够促进生物膜对TCH的“抵抗能力”.

图4 有无外加醋酸钠时海绵载体上生物膜活死菌染色图

2.4 光催化中间产物的利用

图5为不同TCH溶液在VPCB-1和VPCB-2中的HPLC-MS总离子流图及对应的中间产物.可以发现，VPCB-2比VPCB-1积累了更少的中间产物.在反应的前4 h，从VPCB-1和VPCB-2中鉴定出了7个中间体，除了TCH(m/Z=445)，还有m/Z为477，305，329，287，225，171，444和169的物质.m/Z为477和444的中间产物是非常常见的光催化产物，通过TCH的羟基化、·OH反应及在C2—C3双键上失去NH3产生.在所有的中间产物中，这两个产物有4个芳香环，是最不容易生物降解的物质，在第4小时，这两种物质在VPCB-2的强度比VPCB-1低得多，且最后在VPCB-2中消失.此外，除了TCH，在12 h运行后VPCB-2的总离子色谱图中没有出现其他峰.由此我们推测，出水中几乎没有芳香族化合物残留，表明VPCB-2对光催化中间产物具有高效的生物降解能力.而VPCB-1中第4小时出现的所有产物在第12小时仍被检测到，表明VPCB-1中的微生物利用这些产物的能力较低.结果说明VPCB-2中的微生物降解TCH光催化中间产物的能力有所提高.

图5 有无外加醋酸钠的总离子流图和中间产物

2.5 微生物群落结构

从生物多样性和生物群落结构分布(见图6)可以看出，以活性污泥为接种种源进行培养后(图中初始样品)，载体上生物膜群落中的优势菌属分别为Pseudomonas(14.4%)，Zoogloea(25.3%)，Hydrogenophaga(9.7%)，Comamonadaceae(6.6%)和Aeromonas(4.8%).这几种都是典型的活性污泥所包含的菌属.其中，Pseudomonas(假单胞菌属)是活性污泥的主要菌属之一，Zoogloea属是一种在活性污泥中可以形成胞外聚合物的菌属.

对比后可发现，在ICPB中添加电子供体醋酸钠后，载体具有更高的生物量和更好的生物活性，而且与降解芳香环及其衍生物类中间产物相关的菌属Comamonas和Pseudomonas也有一定程度的富集；同时从表征生物多样性的ACE指数也可以看出，VPCB-2比VPCB-1具有更好的生物多样性，这表明添加醋酸钠后生物膜能更好地适应含TCH的废水.在ICPB中生物膜可以适应TCH废水，以中间产物为碳源和能源保持活性和功能性，生物多样性的提高与TCH及中间产物的刺激有关.

样品名序列数/个OTU 数/个ACE 指数初始68 7462 1984 998VPCB-1-4h87 6631 9725 174VPCB-2-4h97 6142 1936 074VPCB-1-12h89 9261 8545 631VPCB-2-12h104 5771 9586 102

图6VPCB-1和VPCB-2运行过程中载体上生物膜的种属相对丰度分布图

本文在VPCB反应器中外加醋酸钠作为电子供体，通过与没有添加醋酸钠的VPCB反应器进行对比后，证明了外加电子供体可以通过提高载体内部微生物的活性加快TCH的降解，光催化中间产物也可被更有效的利用.

[参 考 文 献]

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