电针运动区对MCAO大鼠大脑皮质及血清内NGF和VEGF表达的影响※

马 英 杨春壮 雷 瀛 王子轩 张志远 王思佳 曹雪雪 赵婷婷 刘 星

（牡丹江医学院基础医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

缺血性脑中风因“四高”（高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率）对人类生命安全和健康造成严重危害，因此一直以来是基础和临床医学科学研究的重点、热点和难点。头针是一种行之有效的治疗方法，其蕴含有巨大的科学内涵和实践价值，尤其是简、便、廉、无任何毒副作用的特点是任何其它方法都难以企及的。本研究通过动态观测电针运动区对大脑中动脉闭塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO） 大鼠大脑皮质及血清内NGF和VEGF含量的影响入手，探讨其治疗机制，将为临床应用头针治疗缺血性中风提供实验和理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器、试剂和药物 Multiskan MK3酶标仪（Thermo热电上海仪器有限公司）；神经生长因子β（NGFβ）酶联免疫试剂盒（武汉博士德生物公司）；血管内皮生长因子（VEGF)酶联免疫试剂盒（武汉博士德生物公司）。

1.2 MCAO大鼠模型的制作 选取健康Wistar大鼠72只，雌雄各半，体质量200～350 g[由牡丹江医学院医药研究中心提供，实验动物许可证号:SYXX(黑)2015-007]。首先将大鼠以10% 水合氯醛 （0.3 mL/100 g） 腹腔注射麻醉，仰卧固定于鼠板上，在大鼠颈部前正中线纵行切口，长约2.0～2.5 cm，钝性分离筋膜、肌肉及甲状腺腺体，注意减少刺激迷走神经，分离并结扎右侧颈总动脉（CCA），再穿一线备用。分离颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），结扎ECA，用微动脉夹夹闭ICA，在近CCA分叉处剪一“V”字型切口，将直径为0.2～0.25 mm尼龙线头端涂抹硅胶脂，沿CCA插入ICA，同时放开微动脉夹，轻轻牵拉使栓线进入颅腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，说明线栓已阻断大脑中动脉（MCA）的入口，造成MCA阻塞。将CCA上的备线扎紧，防止线栓滑出，缝合伤口，涂抹青霉素抗炎。1h后，缓慢退出部分线栓进行再灌注。假手术组只做手术暴露颈部动脉，结扎CCA，但不予线栓。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 随机分为假手术组、模型组和电针组，每组各24只。

1.3.2 针刺操作 术后大鼠清醒即开始针刺。

取穴及针刺方法:运动区：即百会穴透太阳穴，顶骨正中斜刺向耳前方。行双侧针刺并加电针，采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪。每天1次，每次30 min，疏密波，5～30 HZ，强度为以大鼠能耐受为度。模型组和假手术组自然饲养，不作特殊处理。

1.3.3 样本采集 各组动物分别于治疗第3天、7天、14天后禁食过夜，在每个时间点随机选取8只，先行尾静脉采血，然后迅速处死取脑，在冰盘上修取右侧（缺血侧）MCA供血区的大脑皮质，用滤纸清除掉黏附的脑脊液和血液，称重标记后按1∶9的比例配入冰生理盐水，置于匀浆器匀浆，血及脑组织再于离心机以3000 r/min离心30 min，取上清用酶联免疫法测NGF和VEGF。

1.4 神经功能障碍评分标准 在治疗第3天、7天、14天后处死前分别进行神经功能障碍评分。评分标准如下：0分：无神经功能缺损表现；1分：症状为提尾悬空时左前爪不能伸展；2分：症状为行走时向左侧转圈；3分：症状为行走困难，并不时地向左侧倾倒；4分：症状为不能自主行走，意识下降。

1.5 统计学方法 实验结果以平均值±标准差 （x±s）表示。采用单因素方差分析进行多组间均数比较。

2 结果

2.1 3组大鼠神经功能评分比较 见表1。

表1 3组大鼠神经功能评分的比较 （x±s，分）

2.2 3组大鼠大脑皮质NGF含量比较 见表2。

表2 3组大鼠大脑皮质NGF OD值比较 （x±s）

2.3 3组大鼠大脑皮质VEGF含量比较 见表3。

表3 各组大鼠大脑皮质VEGF OD值比较 （x±s）

2.4 3组大鼠血清NGF含量比较 见表4。

表4 3组大鼠血清NGF OD值比较 （x±s）

2.5 3组大鼠血清VEGF含量比较 见表5。

表5 3组大鼠血清VEGF OD值比较 （x±s）

3 讨论

中风是中医“风、痨、鼓、膈”四大难证之一[1]。其病理机制为肝肾阴虚，肝亢风动，气血逆乱，上冲犯脑[2]。现代学者们研究认为[3]，脑神经具有可塑性是中风后功能恢复的关键机制。程燕等[4]总结：唐宋前多“内虚邪中”立论，唐宋后多“内风”立论。治疗原则有养阴通督、调理髓海、通阳柔筋、解绌缓急、宣通气血、治督健脑、阴阳调衡、益肾调督、健脾化瘀、醒脑开窍等。督脉为奇经八脉之一，是全身诸阳之总汇，被称为“诸阳总督”，督脉还有沟通阴阳，总摄诸经之能力，因此，“病变在脑，首取督脉”为治疗脑缺血性疾病的首选，百会穴位于督脉之顶，内络于脑，是各经脉所集之处，为督脉益智要穴[5]。本研究选取运动区即百会穴透太阳穴，于此行焦氏头针有醒神开窍，安神定志，平肝熄风的作用。

研究发现，MCAO大鼠可引起大脑皮层和纹状体支配的对侧肢体运动和感觉障碍，主要表现在肌力和运动协调性下降，前肢使用不对称及感觉减退或异常，完全符合临床上的偏瘫、偏身感觉障碍等表现[6]。本研究中假手术组大鼠均未出现神经受损体征，MCAO术后出现以四肢远端为主的不同程度神经功能障碍，如肌张力下降，提尾左前爪内收屈曲，行走时向左转圈或向左倾倒，与临床缺血性脑中风体征相似。同时发现，在连续针刺14 d后，电针组大鼠的神经功能评分明显低于模型组（P<0.01），而针刺3 d、7 d时神经功能评分无明显差异。提示电针运动区能够改善脑缺血大鼠的神经功能，具有神经保护作用，但同时也需要一定的作用时间才可见效。

NGF[7]通过与其特异性Trk A受体结合，参与调节交感及感觉神经元的分化、成熟过程，具有促进神经元的生存，调节突触效力和可塑性的作用[8-9]。有研究表明NGF对损伤神经元具有保护和修复作用。在正常状态下，外源性NGF静滴或肌注后不易透过血脑屏障，但在脑梗死急性期，由于血脑屏障受损，NGF可透过血脑屏障进入中枢神经系统。本研究发现，假手术组大鼠大脑皮质NGF表达在术后无明显差异，模型组在术后第3天开始表达升高，第7天达到高峰，接近假手术组的水平，到第14天表达下降。这一结果提示，脑缺血后可以引起内源性NGF表达增加，这种变化是神经细胞的一种自我保护机制。但其增加时程较短，难以对受损神经元起到全面持久的保护作用。与模型组比较，电针组不同时间点的大脑皮质和血清内NGF表达显著升高（P<0.001，P<0.01），说明针刺能促使脑缺血大鼠内源性NGF产生量增加、产生时限延长，进而保护和修复受损神经。NGF对神经功能缺损的恢复，可能与其促进病灶区神经元和神经纤维的再生、促进受损神经组织蛋白、核酸和脂质的合成及糖的利用并维持再生神经元的功能有关。

VEGF具有促进内皮细胞增生、迁移，增加血管通透性和加速新生血管形成的作用[10-11]。有学者报道[12]，VEGF能够舒张血管平滑肌，刺激恢复血流，进而保护缺血性损伤的脑组织。还有研究报道，早期血清VEGF的含量增加，可建立或开放侧支循环，增加缺血组织的供血供氧，调动处于休眠状态的脑细胞进入功能状态，发挥代偿作用，使已丧失的神经功能重现。另外血清VEGF属于始发因素，可不依赖于血管的形成而直接发挥神经保护作用，这有助于改善神经细胞的存活并利于发挥功能。本实验研究显示，模型组大脑皮质和血清中VEGF的含量都逐渐呈现下降趋势且显著低于假手术组（P<0.001），电针组虽然仍低于假手术组，但与模型组相比，大脑皮质和血清中VEGF含量呈上升趋势，且在针刺第14天时有较显著差异（P<0.01，P<0.05），电针运动区能刺激VEGF的增加，且时间越久，越有利于VEGF的生成，其脑保护作用可能与诱导脑缺血大鼠VEGF的高表达，促进缺血区的血管新生及侧支循环的建立，维系和改善病理状态下的微环境相关。这也验证了神经功能评分的实验结果。

[1]仇立波，孙忠人，张秦宏，等.针刺治疗缺血性脑卒中实验机理研究进展[J].针灸临床杂志，2013，29(2):67-69.

[2]周金芝.针灸治疗中风优势浅析[J].中国中医药现代远程教育，2009，7(3):1-2.

[3]王雪飞，马昕宇，赵因.针刺“手足十二针”改善中风患者运动功能的神经可塑性机制探讨[J].河南中医，2016，36(12):2107-2109.

[4]程燕，丁德光，周仲瑜，等.针灸治疗中风病的临床研究进展[J].内蒙古中医药，2013，32（28）:114-115.

[5]缪化春，吴锋，丁见，等.针联合天麻多糖对脑缺血大鼠齿状回神经干细胞巢蛋白和干细胞因子表达的影响[J].针刺研究，2014，39(1):40-45.

[6]杨杨.针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠行为学及神经血管再生机制的研究[D].北京：北京协和医学院，2016.

[7]兴桂华，吴淑琴，官杰.养寿丹对AD大鼠学习记忆能力及NGF、Trk A蛋白表达的影响[J].中国老年学杂志，2014，34(6):1572-1575.

[8]Guo L，Yeh ML，Cuzon Carlson VC，et al.Nerve growth factor in the hippocamposeptal system:evidence for activity-dependent anterograde delivery and modulation of synaptic activity[J].Neurosci，2012，32（22）:7701-7710.

[9]李倩，黄希艳，朱陵群.片仔癀对局灶性脑梗死大鼠神经生长因子表达的影响[J].神经解剖学杂志，2012，28(5):64-68.

[10]白蓉，王淑.注射用丹参多酚酸对脑缺血大鼠VEGF、IL-10的影响[J].中风与神经疾病杂志，2016，33(5):411-416.

[11]Greenberg DA，Jin K.Vascular endothelial growth factors(VEGFs)and storke[J].Cell Mol Life Sci，2013，70(10):1753-1761.

[12]SangH，Liu L，WangS，et al.VascularVEGF and ICAM-1 expression across experimental diabetic ratswith cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Eur JNeuroscience，2015，15(8):843-849.