Cu²⁺单独污染对藜麦种子萌发及部分生理指标的影响

郝晓华 任美艳

摘 要：采用光照培养箱培养及紫外可见分光光度法，研究了不同浓度（50～200μmol·L-1）Cu2+单独污染对藜麦幼苗体内可溶性蛋白的含量、SOD酶及过氧化氢酶的活性及其他生理特征的影响。结果表明，不同浓度的Cu2+对藜麦的可溶性蛋白含量、丙二醛含量以及叶片的相对电导率伴随着Cu2+浓度的增加而增加；SOD酶及过氧化氢酶活性在随着Cu2+浓度的增加而增加。在含有200μmol/lCu2+的环境下藜麦可以生存，但藜麦体内的保护系统受到一定程度的破坏，然而在低浓度时，Cu2+对藜麦的生长有一定的促进作用。

关键词：Cu2+；藜麦；可溶性蛋白；SOD酶

中图分类号 S519 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）11-0016-05

Abstract：This article using the light incubator to cultivate and atomic absorption spectrophotometry， different concentrations of copper ion was studied after pollution quinoa seedlings in soluble protein content，superoxide dismutase（SOD） and catalase activity and other physical characteristics. The results show that： different concentrations of copper ion of quinoa soluble protein content， malondialdehyde content and relative electrical conductivity increased with the increasing of the concentration of cupric ions. Superoxide dismutase and catalase activity also increased with the increasing of concentration of Cu2+. So quinoa under the environment of containing the highest concentration of copper ion can survive， but protection system in the body of the quinoa by a certain degree is damaged， but in low concentration， the growth of quinoa has a certain role in promoting.

Key word：Copper ion；Chenopodium quinoa willd；Soluble protein；Superoxide dismutase（SOD）

藜麦（Chenopodium quinoa willd）为双子叶植物纲石竹目藜科藜属植物[1]，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐盐碱等特性。原产于南美洲安第斯山区，是印加土著居民的主要传统食物，至今已有5000～7000多年的种植历史。由于其营养丰富，食用价值高，且植株在自然肥力低的情况下仍能生长良好，被誉为未来最具潜力的农作物之一[2]。植株呈扫帚状，根系属浅根系，序状花序，主梢和侧枝都结籽，自花授粉。

近年来，伴随着我国经济的快速发展，环境也遭到了很大程度的破坏，如重金属的污染使很多植物难以生存，或产量下降。Cu2+是一种重要的重金属污染物，其在环境中易积累、难降解[1-2]，过量的铜可使作物细胞膜及多种细胞器的膜系统受损，使K+等从细胞中渗出，抑制多种酶的活性，从而造成毒害效应[3-4]。

本实验主要研究了不同浓度的重金属Cu2+单一污染在藜麦幼苗体内的过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶的活性以及可溶性蛋白和丙二醛含量的变化，为了解铜离子对藜麦的毒害机制和农业生产早期预报重金属污染提供相关的实验依据。

1 材料與方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂 Ca（NO3）2·4H2O、MgSO4·7H2O、CuCl2·2H2O、KNO3、KH2PO4、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、乙二胺四乙酸二钠、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、过氧化氢、高锰酸钾、浓硫酸、Tris浓盐酸、甘油、聚乙烯吡咯烷酮K30、考马斯亮蓝G-250、邻苯三酚、三氯乙酸硫代巴比妥酸、牛血清蛋白、磷酸、95%乙醇、硫酸铜，所用试剂均为分析纯。藜麦种子购于静乐县农贸市场。

1.1.2 试验仪器 DKZ-450恒温震荡水浴锅（常州诺基仪器有限公司）、UNICO UV-2102型紫外可见分光光度计（上海精密仪器有限公司）、LC-4016型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、HC-2062型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、BDS-11A电导率仪（上海雷磁新泾仪器有限公司）、FA2204B电子天平（上海精密仪器有限公司）、TD1102型电子天平（余姚市金诺天平有限公司）、YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅仪器有限公司）、SPX-300B-G型光照培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、MCDE090100CF4实验室pH计（厦门振源工业有限公司制造）。

1.1.3 溶液的配置 （1）Hoagland营养液（1L培养液加入的数量）：大量元素：Ca（NO3）2·4H2O 1.18g、KNO3 0.51g、 MgSO4·7H2O 0.49g、KH2PO4 0.14g。微量元素：H3BO3 2.86mg、MnCl2·4H2O 1.81mg、ZnSO4·7H2O 0.22mg、Na2MoO4·2H2O 0.03mg。每1L营养液中加入2mLFe-EDTA溶液（七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠 3.73g，蒸馏水500mL，配置完成后，在黑暗并低温下储存）。（2）0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液：称取Na2HPO4 22.70g、NaH2PO4 4.82g、用蒸馏水配制成1L；（3）0.1mol/L的过氧化氢溶液：取30%H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL；（4）0.1mol/L高锰酸钾（K2MnO4）：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸过的蒸馏水配制成0.1mol/L的高锰酸钾溶液，并用草酸钠溶液标定，放置7d后使用；（5）蛋白提取液（每100mL加入的数量）：Tris-HCl（pH=8.0）15mL、甘油25mL、聚乙烯吡咯烷酮K302g，定容于100mL。（6）0.05mol/LTris-HCl（pH=8.0）：50mL0.1mol/L Tris溶液与29.2mL的0.1mol/L盐酸，用蒸馏水定容至100mL；（7）考马斯亮蓝G-250染液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL的95%乙醇中，加100mL的85%磷酸混匀，再用蒸馏水定容至1000mL；（8）邻苯三酚（50mmol/L）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存；（9）0.6%硫代巴比妥酸：取0.6g的硫代巴比妥酸，加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10%的三氯乙酸定容至100mL。

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养及实验设计 选取大小均一、饱满的藜麦种子，先用蒸馏水清洗，再用10%的NaClO消毒20min，然后用蒸馏水洗净后，30℃温水浴30min，置于18℃恒温培养箱中培养5h。每50粒排列于铺有数层纱布的培养皿中，共设置6个Cu2+浓度梯度，分别为CK（蒸馏水），50、100、150、200μmol/L。每个浓度处理重复3次，在20℃的光照培养箱中培养，每12h更换一次处理液。

1.2.2 铜离子胁迫下藜麦种子发芽指标 实验中种子发芽均以胚根露白为发芽标准；第4天测定其发芽势，第7天测定其发芽率，并采用普通直尺测量其主根长度和株高。相关计算公式如下：

发芽率（GP）=前7d种子总发芽数/供试种子数[10]；

发芽势（GE）=前4d种子总发芽数/供试种子数[10-11]；

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt）[12]

式中：Dt为发芽日数；Gt为与Dt相应的发芽试验终期内每日发芽数。

活力指数（vigor index，VI）=GI×第7天正常幼苗平均鲜重[13]

式中：幼苗鲜重为称取5株幼苗的重量。

1.2.3 生理指标测定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[14]；相对电导率采用电解质外渗法测定[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用Giannopolitis等[16]的方法测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用Aebi[16]的方法；可溶性蛋白含量采用考马亮斯蓝G-250法测定[17]。

1.3 数据分析 采用Office 2010软件对数据进行处理和绘图，数据用“平均值±标准误”表示，采用DPS统计分析软件对数据进行差异显著性检验，取P<0.05为显著相关，各项指标测定重复3次。

2 结果与分析

2.1 铜离子胁迫对藜麦种子的萌发、株高和主根长的影响 发芽率是衡量种子质量好坏的重要指标，种子能否正常发芽是生长的先决条件[9]。由表1可知，随着Cu2+浓度的升高，藜麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数均呈现逐渐下降的趋势，除50μmol/L与100μmol/L Cu2+浓度处理下，发芽率与发芽势变化差异不显著外，其余各处理间变化差异显著（P<0.05）。低浓度Cu2+（0～100μmol/L）对藜麦种子的发芽率和发芽势无明显的影响，而高浓度Cu2+（150～200μmol/L）則明显抑制了种子的发芽。当浓度升高到150μmol/L时，藜麦种子发芽率明显降低，为对照的91.3%，发芽个数达到供试种子的50%以上，当Cu2+浓度增加到200μmol/L时，藜麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数显著降低，仅为对照的85.8%。在铜离子浓度大于50μmol/L时能够明显的抑制藜麦主根的生长，当铜离子浓度大于100μmol/L时能够明显的抑制植株的生长。

2.2 铜离子胁迫对藜麦幼苗超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响

2.2.1 铜离子胁迫对藜麦幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响 在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2，而H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用，而过氧化物酶可以清除H2O2，是植物体内重要的活性氧清除系统之一。如图1所示：在铜离子浓度低于100μmol/L时，其CAT的活性与对照组相比没有明显的提高，在高于100μmol/l时CAT的活性随着铜离子浓度的增加而增加。

2.2.2 铜离子胁迫对藜麦幼苗超氧化物歧化酶（SOD）的影响 超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2。如图2所示：在铜离子浓度低于50μmol/L其SOD的活性与对照组相比没有明显的增加，而在50～150μmol/L，其活性有明显的增加，相比对照组增加了63.2%，在高于150μmol/L时，其活性增长变缓。

2.3 铜离子胁迫对藜麦幼苗体内可溶性蛋白含量的影响

2.3.1 牛血清蛋白标准曲线 按表1进行操作，待5min后在595nm的波长处测定吸光值，以A595吸光值为纵坐标，牛血清蛋白的数量为横坐标绘制标准曲线，如图3所示。

2.3.2 铜离子胁迫对藜麦幼苗体内可溶性蛋白含量的影响 植物在遭受逆境胁迫时，会改变一些蛋白质的表达，其中在重金属胁迫的条件下会新合成大量的蛋白质以适应环境生长。表3为不同浓度铜离子胁迫下藜麦幼苗体内可溶性蛋白的测定值。如图4所示：在铜离子浓度小于150μmol/L其幼苗体内的可溶性蛋白含量与对照组相比有明显的影响，在铜离子浓度为150μmol/L时，其可溶性蛋白含量增加了53.4%；当铜离子浓度在150～200μmol/L，其可溶性蛋白含量增加逐渐变缓。

2.4 铜离子胁迫对藜麦幼苗质膜的透性以及丙二醛（MDA）含量的影响

2.4.1 铜离子胁迫对藜麦幼苗质膜透性的影响 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要作用。逆境（如重金属）胁迫强度与膜透性增大的程度有关。表4为不同浓度铜离子胁迫对藜麦幼苗质膜相对电导率的测定值。如图5所示：在铜离子浓度50μmol/L时，其质膜的相对电导率没有明显的变化，这说明在此浓度条件下，对细胞膜的损坏程度较低，而在铜离子浓度大于50μmol/L时，其相对电导率随着铜离子浓度的增加而逐渐增加，说明在浓度为200μmol/L时，细胞质膜受损程度较大。

2.4.2 铜离子胁迫对藜麦幼苗体内丙二醛（MDA）含量的影响 MDA是细胞膜脂质过氧化的产物之一，其含量高低可反应细胞膜脂质过氧化的水平和膜受伤害的程度。表5为不同浓度铜离子胁迫下藜麦幼苗体内丙二醛含量的测定值。如图6所示：在铜离子浓度50μmol/L时，其藜麦幼苗体内丙二醛（MDA）含量没有明显的变化，说明在此浓度条件下，细胞膜膜脂的氧化程度较低并且质膜的损坏程度较低，而在铜离子浓度大于50μmol/L时，其MDA的含量随着铜离子浓度的增加而逐渐增加，说明在浓度为200μmol/L时，细胞膜的膜脂氧化程度较大并且质膜受损程度较大。

3 结论与讨论

由本试验研究可知，铜离子对藜麦的正常生长影响显著，随着营养液中铜浓度的升高，藜麦幼苗体内可溶性蛋白含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性以及叶片的相对电导率呈上升趋势，其原因主要为：铜离子的胁迫对藜麦的保护系统造成了一定的损伤，使细胞膜过度氧化，并且丙二醛作为细胞膜氧化的主要产物，因此其含量增加；在正常状态下，细胞膜的电导率是一定的，由于细胞膜的破坏，细胞膜的通透性发生了改变，如：K+的大量外流，使细胞膜的相对电导率增加；由于不同浓度的铜离子在胁迫藜麦幼苗时使细胞膜过度氧化，为了防止其氧化细胞自身，使其体内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性大大增加，从而抑制细胞膜的氧化，同时可溶性蛋白的含量也随之增加。

主根长下降的趋势大于株高下降趋势，其具体原因未知，原因可能为：由于根长时间接触含有不同浓度铜离子的营养液，使其受到的抑制要大于地上部分；根对铜离子的敏感性要大于地上部分；根的保护系统没有叶片的保护系统发达，在铜离子胁迫时根的损害程度大于地上部分。

今后，除加强对“三废”和不合格农药、化肥的监测外，还应该在藜麦栽培上，对已发生铜污染的农田，采取科学施用化肥、农药，适当增施有机肥料、无土栽培等措施，尽力创造适宜藜麦生长发育的环境，使其在较多环境中生存，用来解决粮食问题，并给农民带来丰厚的收入。

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（责编：张宏民）