弥漫性轴索损伤生物标志物的研究进展*

朱士胜，张　鹏　综述，赵　鹏，李剑波△审校（.重庆医药高等专科学校医学技术学院，重庆4033；2.重庆医科大学基础医学院法医学教研室，重庆40006；3.重庆市刑事侦查工程技术研究中心40006；4.遵义医药高等专科学校临床系，贵州遵义563006）

弥漫性轴索损伤（DAI）是一种常见的脑损伤，是造成重型脑损伤患者不良预后的主要原因之一，其病理特点是轴索广泛的损害[1]。DAI严重危害患者的生命健康，其病理生理机制仍不清楚，临床迄今为止尚无治疗DAI的有效药物和措施。近年来，随着研究的不断深入，在DAI的早期诊断、治疗及预后等方面已取得了很大的进展，发现了较多与DAI发病机制、早期诊断与预后评估相关的特异性强、灵敏性好的生物标志物，为进一步探索DAI的病理生理机制、了解DAI患者的症状、体征及病程进展，提高DAI的诊治水平提供了重要参考。现就弥漫性轴索损伤生物标志物的研究进展进行综述。

1　研究背景

DAI尚无统一的诊断标准。临床上DAI的诊断主要依赖于典型的临床表现和影像学检查[2]；然而，DAI的临床症状十分复杂，部分DAI患者（尤其是轻型DAI患者）无特殊的临床表现，同时，CT检查受其分辨率限制，存在灵敏性差、假阴性较高的缺陷。常规MRI检查在DAI诊断方面优于CT，然而，相当一部分DAI患者仍不能被CT或MRI等影像检查发现[3]。其他先进的影像学技术，如 DWI、DTI、梯度回波序列（GRE）-磁敏感加权成像（SWI）等在DAI的诊断中也有应用，但这些影像学技术耗时长、检查时对患者要求高、成本昂贵，严重限制了其应用的范围[3]。由于目前临床检查无法满足对DAI的诊断、疗效评价、预后评估等方面的需求。为了早期、准确地诊断DAI，弥补影像学及临床特征诊断DAI的不足，众多学者积极地研究与DAI发病机制、早期诊断与预后评估相关的生物标志物。

2　DAI的生物标志物

2.1神经丝蛋白（NFs） NFs主要定位于轴突，是组成细胞骨架的一部分[4]。NFs是由3条多肽链构成，分别为轻链（NF-L，68×103）、中链（NF-M，160×103）和重链（NFH，200×103）[5]。每个 NFs亚单位具有一个长且含有大量高度磷酸化的羧基末端。非磷酸化的NFs亚基位于神经元胞体内，可随着轴突运输流动，并可在轴突断端积累[6]。NFs磷酸化的程度与轴突直径和轴突运输的速度呈正相关[7-8]。NFs亚基的磷酸化和去磷酸化之间的平衡在调节轴突组织结构和功能中发挥重要作用。

当发生DAI时，神经细胞膜通透性增高，钙离子内流入神经轴索并激活钙调磷酸酶，扰乱了NFs亚基的磷酸化状态，导致细胞骨架完整性局部丧失。随后，活化的钙蛋白酶和半胱天冬酶-3可介导NFs的去磷酸化和蛋白的水解，导致NFs在轴突中心塌陷成紧密包裹的束，这些改变导致了NFs的降解。JAFARI等[9]研究发现，猪发生DAI后NFs在轴突间隙含量降低52.9%。

轴索损伤后，NF-L会在几个小时内降解为多肽片段[6]。大鼠和猪的动物实验表明，磷酸化的NF-L水平于伤后30 min至6 h在胼胝体内降低50%[6]。NF-L的免疫反应于伤后1 d增高，伤后3 d增加更加显著。NF-L免疫反应研究发现，伤后6 h轴索出现肿胀、扭曲；伤后24hNF-L免疫反应结果发现大量轴索肿胀，直径为10µm，并可在轴索断端发现典型的收缩球。同时，研究发现，NF-L免疫反应并未出现在神经元胞体和树突。因此，在NFs的3个亚基中，NF-L对神经轴索的损伤最敏感和特异。NF-L片段也可以在脑脊液（CSF）中检测到，其最低检测含量为5 ng/L，是中型创伤性脑损伤CSF含量的平均值。

目前仍未发现NF-M可作为轴索损伤的标志物。动物实验发现，轴索损伤24 h后NF-M可呈阳性反应[6]。磷酸化的NF-H可于伤后6 h在血清中检测到，并于伤后12 h初次达到峰值，随后降低，并于伤后2 d达到更高的峰值，最后于伤后7 d降低至正常水平。伤后血清中磷酸化NF-H水平的变化规律，可能与DAI中原发性轴索断裂和继发性轴索断裂相对应；提示继发性轴索断裂可能较原发性轴索断裂对轴索的损害更重。磷酸化的NF-H有望成为评估患者轴索损伤新的特异性潜在标志物[5]。

2.2微管相关蛋白tau（MAP-tau） MAP-tau是与微管蛋白结合的一类蛋白，相对分子质量为48×103～67×103[10]。MAP-tau具有稳定微管结构、参与轴浆转运的作用。在生理状态下，MAP-tau不易被检测到。轴索损伤时，激活的中性蛋白酶会解聚胞体和轴索的微管，导致MAP-tau的过度磷酸化，引起神经纤维的缠结。同时，MAP-tau可被钙蛋白酶1、3裂解为C-tau，而C-tau可扩散到CSF和血清，这使得其有望成为一种潜在的特异性的DAI生物标志物[11]。

有研究发现，血清及CSF中C-tau的水平与患者临床病情改善、预后呈负相关，提示其可用于患者轴索损伤程度评估、药物疗效监测等[11]。同时，CSF中C-tau的水平可在CT检查未见异常的患者中升高，提示其可作为轴索损伤有价值的生物标志物[11]。

2.3髓鞘碱性蛋白（MBP） MBP是脑白质中含量最多的蛋白质之一，约占髓鞘蛋白的30%；由4个主要的亚基组成，相对分子质量分别为 21.5×103、18.5×103、17×103、14×103[12]。轴索损伤后，激活的钙蛋白酶、基质金属蛋白酶和溶酶体蛋白酶会导致MBP亚基的降解。

动物实验研究发现，挫伤的脑皮质内MBP的含量于伤后2 h降低，并于伤后2 d降低至最低水平，随后于伤后3～7 d升高至正常水平。相应地，MBP氮端相对分子质量为8×103～10×103的降解产物，最初于伤后2 h在脑皮质中积累，于伤后1～2 d升高至峰值，并于伤后6～7 d恢复至正常水平。MBP降解产物可在CSF中检测到，然而其灵敏性较在脑皮质差。血浆中MBP降解产物于伤后2～3 d升高，并可持续至伤后2周。有研究结果表明，MBP作为DAI标志物的灵敏性为87%，特异性为100%[13]。虽然，MBP在过去很长一段时间被认为是创伤性脑损伤的潜在生物标志物，但是由于其灵敏性较差，严重限制了其临床应用。

2.4β淀粉样前体蛋白（β-APP） β-APP是神经细胞胞质中合成的一种跨膜糖蛋白；其可通过快速轴浆转运至突触。β-APP在细胞黏附、神经元的生长和损伤后修复中发挥着重要作用[14]。在生理状态下，β-APP含量较低，不能通过免疫组化方法检测到。DAI时β-APP可在轴索收缩球（ARB）内快速、大量积累。β-APP可以标记脑白质中损伤的轴索和ARB。目前，β-APP在法医学中被认为是诊断DAI的有效生物标志物，检出率为85%[15]。然而，有研究发现，β-APP存在标记损伤轴索率低的缺陷，为 30%～50%[16]。

前期研究发现，苏木素-伊红（HE）染色可在颅脑伤后24 h检出ARB，嗜银染色可在伤后15～18 h检出ARB[17]。β-APP免疫组化法的灵敏性较HE染色和嗜银染色高，可在伤后30 min至1 h内检出轴索损伤，在伤后3 h内检出ARB[18]。

动物实验研究发现，伤后β-APP mRNA可在30 min内表达上调，提示其可作为DAI早期诊断的潜在生物标志物，其灵敏性优于MBP及NFs[19]。然而，值得注意的是，β-APP也可在颅脑损伤后非神经系统结构，如施旺细胞和血小板中阳性表达；同时，研究还发现，缺氧缺血性脑损伤、一氧化碳中毒、低血糖症、腔隙性脑梗死患者β-APP也可存在阳性表达。因此，应用β-APP诊断DAI时需特别谨慎以免误诊。目前研究认为，β-APP不应作为DAI诊断的特殊标志物，而应作为广泛性脑损伤的标志物[20]。

2.5淀粉样蛋白（Aβ） Aβ是由40～42个氨基酸组成的水溶性多肽。生理状态下Aβ合成后主要分泌到神经细胞外，其浓度低于检测水平。DAI后，Aβ可由于β-APP的酶解而在神经元胞体内大量聚集[21]。大量聚集的Aβ具有神经毒性。同时，由于Aβ抗体与β-APP抗体具有相同的分子结构，故Aβ免疫组化反应时β-APP也可呈阳性表达[22]。

动物实验研究发现，Aβ于伤后1 d在大脑皮层及海马神经元胞体内积累，伤后3 d增加更加明显，伤后6～14 d持续增加；同时，可在大脑皮层下白质的轴索发现Aβ与NF-L中度至重度免疫组织阳性反应。在对照组实验动物神经元的胞体和轴突中可发现Aβ微弱的免疫组织阳性反应。前期研究发现，Aβ在患者的CSF中也显著增加，并于伤后5～6d升高至正常值的11.73倍，达到峰值；随后的2周，Aβ水平逐渐降低至正常水平[23]。血浆中Aβ的水平为CSF中的1/100，且伤后不会出现显著改变，这提示血浆中Aβ水平不能反映CSF中Aβ的代谢情况[21]。

2.6FE65FE65是一个保守的蛋白质，其95%的氨基酸序列在人类、小鼠和大鼠相同，因此，FE65动物实验的结果可能较好地推广至人类。FE65是一种衔接蛋白，其参与了β-APP与其细胞内固定区域的衔接。DAI后，FE65表达的上调会导致β-APP在神经元胞体内的聚集[23]。大鼠实验研究发现，FE65 mRNA水平可于伤后30 min升高，并于伤后1 h达到峰值，于伤后12 h降低至正常水平；随后，FE65 mRNA水平于伤后24 h再次升高，伤后48 h再次降低[24]。FE65 mRNA变化规律可能与DAI原发性轴索断裂和继发性轴索断裂相关。尽管目前仍缺乏人发生DAI后FE65 mRNA、FE65的变化规律，但上述动物实验已表明，FE65 mRNA和FE65有望成为DAI早期诊断的特异性的生物标志物。

2.7神经元特异性烯醇化酶（NSE） NSE是糖酵解酶烯醇酶的同工酶，相对分子质量为78×103。NSE主要位于神经元细胞质中，其主要参与神经元慢速轴浆转运[25]。生理状态下，NSE不会被分泌到细胞外。轴索损伤后，上调的NSE会被释放到细胞外[26]，因此，体液中NSE对轴突损伤具有较高的特异性和敏感性。

动物实验发现，NSE可于轴索损伤后1.5 h呈免疫组化阳性反应；这提示其可作为DAI早期潜在生物标志物。然而，近期研究发现，红细胞及血小板中也存在NSE，这可能会严重限制NSE在DAI诊断中的应用[27]。尽管如此，研究发现，NSE可作为重症颅脑损伤患者预后判断、治疗效果监测的生物标志物[28]。前期研究发现，DAI后6个月内，NSE水平与格拉斯格预后评分（GOS评分）呈正相关；NSE作为评估患者预后的标准具有良好的灵敏性和特异性，基于此灵敏性和特异性，NSE有望作为DAI患者预后判断的生物标志物，对患者预后评估有重要意义[29]。

2.8其他其他与DAI诊断、预后评估等相关的生物标志物还包括环氧合酶2、水通道蛋-4、白细胞介素1（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、碱性成纤维细胞生长因子等[2]。部分DAI生物标志物汇总见表1。

表1　与DAI病理生理机制、早期诊断、预后评估相关的生物标志物

3　展　望

DAI生物标志物的探索是一个相对较新的领域，随着研究的不断深入，虽然发现了较多与DAI发病机制、早期诊断与预后评估相关的生物标志物，但是由于前期研究工作大多数侧重于发现单一的生物标志物，故目前仍未筛选出灵敏性好、特异性强的可应用于临床DAI患者早期诊断与预后评估的生物标志物[29]。

发生DAI后轴索的损伤是多因素参与的、一系列原发性或继发性病理生理反应的结果，因此，单一的生物标志物无法准确地对DAI患者进行早期诊断、预后评估等，联合使用多个生物标志物可能会得到更佳的结果[29]。随着组学技术和生物信息学技术的兴起和不断发展，已有学者运用蛋白质组学技术、代谢组学技术等研究DAI患者或实验动物的脑组织、血浆、CSF等，筛选出潜在的生物标志物，以期为DAI的发病机制、早期诊断提供了新的研究思路，并已取得了较理想的研究结果[30]。同时，尽管前期研究发现，DAI体液生物标志物存在特异性较差的缺陷，但是，体液具有易获得、临床应用简便等优点，故DAI体液生物标志物的探索仍是今后研究的重点[29]。

总之，作为一个具有较高的致残率、植物生存率、死亡率的特殊脑损伤类型，DAI的早期诊断、药物治疗靶点的确定、预后评估及鉴定等一直困扰临床工作者和法医学者。生物标志物的探索为解开这个难题提供了新的思路，并经过近些年的研究，取得了一定成果。随着组织学技术和生物信息学技术的不断发展和完善，必将寻找到与DAI的发病机制、早期诊断与预后评估相关的特异性强、灵敏性好的生物标志物。