迷迭香提取物在体外和萨拉米中的抗氧化活性

姜 蕾，康大成，张万刚，周光宏

（南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

萨拉米是一种典型的西式发酵香肠，其以猪肉、牛肉为原料，利用微生物或组织内源酶发酵作用生产，经发酵干燥而成。因其具有特殊的风味、色泽和质地而深受世界各地消费者的喜爱，然而在长期高温高湿的加工条件下，萨拉米易发生过度氧化。在加工过程中，适度的脂肪氧化、蛋白质氧化、水解等反应可产生醛类、醇类等风味物质，有利于萨拉米的品质形成。此外，脂质氧化产生的一级产物还可与氨基酸、肽等发生美拉德反应，进一步形成大量的风味成分[1-2]。但过度氧化会对其风味、质地和色泽等品质产生不良影响。萨拉米的脂肪含量相对较高，脂肪过度氧化会产生哈喇味，从而严重影响产品的感官品质和食用品质[3]。同时，现代医学研究表明，脂肪氧化产物可诱发多种慢性疾病，是人体衰老和心血管疾病的主要诱因[4]。因此，在生产过程中控制好脂肪和蛋白质的氧化程度对萨拉米风味的形成和品质控制至关重要[5]，有助于提高产品的品质和安全性，延长产品的货架期。

控制发酵香肠氧化酸败的常用方法是添加抗氧化剂。目前工业上使用的大多数是合成抗氧化剂，虽然抗氧化效果好，但其安全性一直备受质疑，因此在很多国家，化学合成的抗氧化剂已经被禁止使用在肉制品中。现在人们逐渐将目光转向天然抗氧化剂。研究证明，许多药草以及植物香辛料提取物都具有很好的抗氧化和抑菌作用[6]，迷迭香便是其中比较常见的一种。Jongberg等[7]发现迷迭香提取物可以有效抑制脂肪氧化导致的硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）和蛋白质氧化形成的羰基含量上升。孙卫青[8]研究发现迷迭香提取物可以有效抑制猪肉和牛肉切片火腿的脂肪氧化，还能减缓色素亚硝酰血色原的降解，提高切片火腿的红度。殷燕等[9]研究发现迷迭香提取物能显著抑制熟猪肉饼贮藏过程中的脂肪氧化和微生物生长，并能在一定程度上改善熟猪肉饼的颜色和质构。Doolaege等[10]发现迷迭香提取物抑制猪肝肉酱的脂质氧化效果显著。刘骞等[11]研究发现，在冷藏牛肉丸中迷迭香提取物的抗氧化性能优于丁香和肉桂提取物，略差于丁基羟基茴香醚。Nissen等[12]的实验也表明熟肉饼中添加迷迭香提取物的抗氧化效果显著优于添加茶、葡萄皮和咖啡提取物。以上研究表明迷迭香提取物在肉制品中的抗氧化效果较为显著，并且有利于维持肉制品色泽的稳定、抑制微生物的生长，还能赋予肉制品一定的风味。色泽和风味对于萨拉米的品质来说尤为重要，因此本实验将迷迭香提取物添加到萨拉米中，研究其对萨拉米抗氧化和食用品质的影响，并与人工合成的抗氧化剂进行对比，探讨迷迭香提取物在萨拉米中的商业化应用，及其替代合成抗氧化剂的可能性，提高肉制品的品质稳定性及安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

迷迭香粉 河南森源本草天然产物股份有限公司；原料肉（猪瘦肉、猪背膘、牛肉） 江苏食品集团；发酵剂F1 科汉森食品添加剂有限公司；胶原蛋白肠衣（Ф＝23 mm） 广西神冠蛋白肠衣有限责任公司；1,1-二苯基-2三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）试剂盒美国Cell Biolabs公司；L-半胱氨酸 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；盐酸胍、Tris-Base 合肥新恩源生物技术有限公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZKSY-600恒温水浴锅 南京科尔仪器设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机 德国Christ公司；AvantiJ-E离心机 美国Beckman Coulter公司；Spectral Max®M2e多功能酶标仪美国MD公司；8010ES高速匀浆机 美国Warring公司；TC 12E绞肉机 意大利Sirman公司；BZBI-15斩拌机嘉兴艾博不锈钢机械工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香提取物的制备

参考谢冬惠[13]的方法并稍作改动。称取迷迭香粉末100 g，加入500 mL体积分数70%乙醇溶液，70 ℃水浴加热回流提取2 次，每次2 h，过滤后获得迷迭香样品液，将样品液旋转蒸发回收溶剂得到浓缩液，将浓缩液真空冷冻干燥48 h得到迷迭香乙醇提取物。将提取物包装后于4 ℃冷库保存待用。

1.3.2 萨拉米的制作

萨拉米配方：65%猪瘦肉（质量分数，下同）、30%猪背膘、5%牛肉。0.01%亚硝酸钠、0.01%硝酸钾、3.7%香辛料（食用盐、葡萄糖、黑胡椒粉、小茴香粉、大蒜粉等）、0.025%发酵菌种F1。本实验设定5 个实验组：空白对照组（CK组，不添加抗氧化剂）、阳性对照组（SE组，添加0.02%异抗坏血酸钠），分别添加0.01%、0.02%、0.03%迷迭香提取物的3 个处理组（R0.01组、R0.02组、R0.03组）。

工艺流程：原料肉预处理→绞碎→腌制（将迷迭香提取物粉末与其他香辛料一起混匀，直接加入绞碎的肉中）→接种→斩拌→灌装→发酵→成熟→真空包装→成品。

本实验选取5 个取样时间点：分别是第0天（所有成分混合均匀后和灌肠前）、第2天（发酵结束）、第7天（干燥过程）、第10天（干燥过程）、第14天（干燥结束后的成品）。对5 个实验组分别取样测试，每个实验组3 个重复。

1.3.3 迷迭香提取物总酚含量的测定

参照Hinneburg等[14]的方法并适当修改。准确称取0.2 g迷迭香提取物粉末，用体积分数70%乙醇溶液溶解后定容于100 mL容量瓶中，配制成2 mg/mL的母液。吸取0.1 mL母液于10 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL福林-酚试剂和3.0 mL 100 g/L的Na2CO3溶液，蒸馏水定容、混匀。室温下避光反应2 h，于765 nm波长处测吸光度。用没食子酸作标准液绘制标准曲线，将吸光度代入回归方程，计算多酚质量浓度/（μg/mL）。迷迭香提取物中的多酚含量以没食子酸标准品计，结果以每克提取物中没食子酸的质量表示。用提取溶剂作空白对照。

1.3.4 迷迭香提取物体外抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考Mielnik等[15]的方法并稍作改进。用体积分数70%乙醇溶液将迷迭香提取物粉末溶解并稀释至不同质量浓度，取1 mL样品溶液与1 mL DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L，体积分数70%乙醇溶液溶解）混合，充分混匀后于室温避光放置30 min。在517 nm波长处测定混合液的吸光度，记为A1，1 mL体积分数70%乙醇溶液与1 mL DPPH自由基溶液混合作为空白组，吸光度记为A0。用1 mL样品溶液与1 mL体积分数70%乙醇溶液混合作为对照，吸光度记为A2。迷迭香提取物对DPPH自由基的清除率按下式计算。

同时，配制与上述样品溶液相同质量浓度梯度的异抗坏血酸钠作为对照，按照上述测定方法检测其DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 ORAC的测定

参考Huang Dejian等[16]的方法并作适当修改。迷迭香提取物和抗氧化标准物质水溶性VE（Trolox）用体积分数70%乙醇溶液溶解并稀释至不同质量浓度。荧光物质、自由基产生剂2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）均用磷酸盐缓冲液（75 mmol/L、pH 7.2）溶解并稀释至适当浓度，ORAC反应在磷酸盐缓冲液体系中进行。吸取25 µL不同质量浓度的待测样品溶液于96 孔的黑色荧光酶标板各微孔中，加入150 µL荧光物质溶液（8.61×10－5mmol/L），混匀，在37 ℃下孵育30 min，再加入25 µL AAPH溶液（153 mmol/L），混匀后立即在37 ℃条件下，以激发波长480 nm、发射波长520 nm连续测定荧光强度，每2 min测定一次荧光强度，直至荧光衰减呈基线后测定结束，共测定60 次。本实验需要设定两种对照，即没有添加荧光物质的荧光自然衰减对照（记为－AAPH）和没有样品溶液存在时的自由基对照（记为＋AAPH）。

抗氧化剂的ORAC是通过抗氧化剂的保护面积与标准抗氧化物质的保护面积相比得出。待测样品的ORAC以μmol Trolox/g表示。

同时，配制与上述样品溶液相同质量浓度梯度的异抗坏血酸钠作为对照，按照上述方法测定其ORAC。

1.3.4.3 还原力测定

参考郑锦晓等[17]的方法并稍作改进。配制不同质量浓度的样品溶液，取2 mL样品溶液与2 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2 mL铁氰化钾溶液（10 mg/mL）混匀，50 ℃水浴20 min。再加入2 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（100 mg/mL）溶液，将混合液在3 000 r/min离心10 min。吸取2 mL上清液，加入2 mL蒸馏水和0.4 mL三氯化铁（质量分数0.1%），充分混匀，室温避光放置10 min后于700 nm波长处测其OD值。反应体系的OD值越高表明还原力越强。

同时，配制与上述样品溶液相同质量浓度梯度的异抗坏血酸钠作为对照，按照上述测定方法检测其还原力。

1.3.5 萨拉米氧化指标的测定

1.3.5.1 TBARS含量的测定

参考Raharjo[18]和Wang[19]等的方法并稍作改进，取5 g肉样，加入20 mL蒸馏水和25 mL质量分数20% TCA溶液，在冰水浴中10 000 r/min匀浆两次，每次30 s。然后以4 ℃、4 000 r/min离心10 min，过滤，滤液用蒸馏水定容至50 mL，取2 mL滤液加入2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸，在95 ℃水浴80 min，取出用流水冷却10 min，再以4 000 r/min离心，取上清液在523 nm波长处测吸光度。空白样为25 mL 20%质量分数TCA溶液加蒸馏水定容至50 mL，其他步骤如上所述。用四乙氧基丙烷作标准曲线，TBARS含量通过标准曲线计算，结果以每千克样品中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的质量表示。

1.3.5.2 总巯基含量的测定

参考Fu Qingquan等[20]的方法，取1 g肉样，加入5 mL的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）混匀，在8 000 r/min条件下匀浆30 s。取0.1 mL匀浆液于离心管中，加入0.9 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0，其中包含8 mol/L的尿素、10 mmol/L的乙二胺四乙酸和0.6 mol/L的氯化钾），再加入0.04 mL 10 mmol/L 5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）。混合液在40 ℃条件下反应25 min。在10 000×g条件下离心5 min，取上清液在412 nm波长处测其吸光度。用二辛可酸法测蛋白质量浓度后，以半胱氨酸作标准曲线计算总巯基含量。

1.4 数据统计分析

实验重复3 次，所有数据采用SAS 8.0软件进行统计分析，差异显著性分析采用Duncan’s Multiple Range Test模式，用Graphpad Prism软件作图，数据表示为，以P＜0.05表示差异显著，以P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 总酚含量的测定结果

本研究测定的回归方程为：y＝0.048 3x＋0.002 6，相关系数为0.995 3。将吸光度代入回归方程，计算得出迷迭香70%乙醇提取物中总酚含量为197.6 mg/g（19.8%），稍高于Calabrese等[21]测得的迷迭香总酚含量（18.5%）。有研究表明，迷迭香提取物中起抗氧化作用的主要成分为酚类物质[22]。迷迭香的生长环境和加工贮藏方式等可能会影响迷迭香提取物中总酚含量，提取溶剂和检测方法的不同也会造成总酚含量的差异。

2.2 迷迭香提取物体外抗氧化活性评价结果

2.2.1 DPPH自由基清除能力

图1 迷迭香提取物和异抗坏血酸钠对DPPH自由基的清除效果Fig. 1 Scavenging effect of rosemary extract and sodium erythorbate on DPPH free radicals

如图1所示，质量浓度在5～500 μg/mL之间时，迷迭香提取物DPPH自由基清除率为24.63%～100.00%，异抗坏血酸钠DPPH自由基清除率在29.85%～78.44%之间。当质量浓度小于80 μg/mL时，迷迭香提取物的DPPH自由基清除能力显著低于异抗坏血酸钠（P＜0.05）；当质量浓度大于80 μg/mL时，迷迭香提取物的DPPH自由基清除能力显著高于异抗坏血酸钠（P＜0.05）。这可能是由于DPPH自由基为脂溶性，本实验所提取的迷迭香提取物也为脂溶性，在质量浓度较高时二者的亲和作用更显著[23-24]。而且异抗坏血酸钠在较高质量浓度下可能存在自氧化现象，这会导致其清除率有所下降。张莹[25]的研究表明，迷迭香的DPPH自由基清除能力与其酚类物质含量呈正相关。

2.2.2 迷迭香提取物的ORAC

图2 Trolox系列浓度标准溶液的荧光强度随时间衰减曲线Fig. 2 Attenuation curve of fluorescence intensity of Trolox standard solutions

如图2所示，Trolox系列浓度标准溶液的标准曲线回归方程为y＝0.413 6x＋3.954 7，相关系数为0.995 7。迷迭香提取物的ORAC为2 920.3 μmol Trolox/g，显著高于异抗坏血酸钠的ORAC（1 746.9 μmol Trolox/g）（P＜0.01）。徐维盛等[26]对山楂的ORAC与其不同抗氧化活性成分含量进行了相关性分析，结果表明山楂鲜果ORAC与其多酚含量存在正相关关系。迷迭香提取物具有较高的ORAC，可能也与其较高的总酚含量有关。

2.2.3 还原力的测定结果

图3 迷迭香提取物和异抗坏血酸钠的还原能力Fig. 3 Reducing power of rosemary extract and sodium erythorbate

从图3可看出，在5～300 μg/mL质量浓度范围内，迷迭香提取物的还原力随着质量浓度的升高而显著增强（P＜0.05），但各个质量浓度下的清除率均显著低于异抗坏血酸钠（P＜0.05）。在质量浓度为400 μg/mL和500 μg/mL时，迷迭香提取物的还原力与异抗坏血酸钠无显著差异。说明在达到一定的质量浓度时，迷迭香提取物表现出了较好的还原能力，且还原效果与异抗坏血酸钠相当。

上述3 种体外抗氧化评价体系的结果表明，总酚含量为197.6 mg/g的迷迭香提取物具有良好的清除DPPH自由基和活性氧自由基的能力以及还原力。因此，可对迷迭香提取物作为天然抗氧化剂应用在发酵香肠萨拉米中的抗氧化效果进行进一步的研究。实验参考上述体外抗氧化活性结果中质量浓度范围，分别将质量分数为0.01%、0.02%和0.03%的迷迭香提取物应用到萨拉米的制作中，测定其对萨拉米加工过程中脂肪和蛋白质氧化的影响。

2.3 迷迭香对萨拉米加工过程中脂肪和蛋白质氧化的影响

2.3.1 迷迭香对萨拉米TBARS含量的影响

图4 不同质量分数迷迭香提取物对萨拉米加工过程中TBARS含量的影响Fig. 4 Effects of different amounts of rosemary extract added on TBARS contents of salami during processing

脂肪氧化程度是决定食品质量的重要因素，它能导致食品变色及产生不良气味，影响食品的食用安全[27]。TBARS含量是评价脂肪过氧化程度的重要指标，主要反映了脂肪次级氧化产物MDA的含量[28]。随着脂肪氧化程度的加深，次级产物不断增多，TBARS含量也不断增大。由图4可知，萨拉米在整个加工过程中TBARS含量总体呈上升趋势，在发酵期间上升缓慢，可能是由于发酵产物的大量生成，而发酵产物本身就具备一定的抗氧化能力[29]，干燥后期TBARS含量上升迅速。在第0、2、7天，5 个实验组之间的TBARS含量没有显著差异。在第10天，R0.03组的TBARS含量显著低于CK组，其他4 个实验组之间的TBARS含量无显著差异。第14天，SE组和R0.03组的TBARS含量显著低于CK组（P＜0.05），R0.02组和R0.01组的TBARS含量与CK组无显著差异。说明在加工过程中，R0.03组可以显著抑制萨拉米TBARS含量的升高，SE组次之；R0.02组与R0.01组不能显著抑制萨拉米在加工过程中TBARS含量的升高。在加工结束时，R0.03组的TBARS含量显著低于SE组，说明质量分数0.03%的迷迭香提取物可以有效地减轻萨拉米脂肪过氧化情况。有报道认为，迷迭香中的迷迭香酚、鼠尾草酸等酚类物质可以替代自由基与不饱和脂肪酸结合，从而抑制脂肪氧化[30]。Lara[31]和殷燕[32]等的研究表明，添加了迷迭香提取物的猪肉饼在0～3 d的冷藏期间自由基团的含量显著高于对照组，说明迷迭香发挥了替代自由基与不饱和脂肪酸结合的作用。

2.3.2 迷迭香对萨拉米总巯基含量的影响

图5 不同质量分数迷迭香提取物对萨拉米加工过程中总巯基含量的影响Fig. 5 Effects of different amounts of rosemary extract added on total thiol content of salami during processing

所有蛋白质的氨基酸侧链均可被自由基攻击，但不同氨基酸对自由基的敏感程度不同。半胱氨酸具有高度敏感的含硫元素活性中心，因此在所有氨基酸残基中，半胱氨酸最容易被氧化形成二硫键导致巯基消失[33]。总巯基含量可以用来反映蛋白质氧化的程度[34]，总巯基含量越低表示蛋白质氧化程度越严重[35]。从图5可看出，在加工过程中，萨拉米的总巯基含量在0～2 d显著下降（P＜0.05）。在第0天时，5 个实验组的总巯基含量无显著差异。在第2天时，SE组的总巯基含量显著高于其他4 个处理组。在第7天时，R0.03组的总巯基含量显著高于SE组，在第10、14天时R0.03组的总巯基含量与SE组无显著差异（P＜0.05）。在第14天时，添加迷迭香的3 个处理组的总巯基含量均与SE组无显著差异，除R0.01组外，SE组和其余两个迷迭香处理组的总巯基含量均显著高于CK组（P＜0.05）。本实验中，在发酵期间的第0、2天，所有样品的总巯基含量均呈现出快速大幅下降的趋势，这主要是由于发酵期间蛋白质量浓度迅速提高了3～5 倍，蛋白质量浓度的迅速升高可能是由于发酵初期乳酸菌等发酵菌种大量繁殖，菌体蛋白也会被二辛可酸法检测出，并与肌肉中的蛋白质一起被计入结果，因此导致蛋白质量浓度的升高。添加的发酵菌种在发酵过程中产生大量乳酸等有机酸，对肌肉中的结缔组织有弱化作用，从而使肌肉中的不可溶性胶原蛋白转化为可溶性胶原蛋白，也可能导致蛋白质量浓度有所上升[36]。另外，pH值下降可能会造成肌原纤维蛋白的解绑以及吸附能力下降，使肌原纤维的结构遭到破坏，提高肌球蛋白和肌动蛋白的溶出能力[37]，同时pH值下降也会造成蛋白质水解酶活性下降。研究表明胰蛋白酶的含量下降会导致总巯基含量的下降[38]。第7、10、14天的蛋白质量浓度相对较稳定，因此这3 个时间点的总巯基含量变化更具有参考意义。通过第7、10、14天3 个时间点的总巯基含量可以看出，添加质量分数为0.02%和0.03%的迷迭香提取物可以显著抑制萨拉米的蛋白质氧化，并且呈现出一定的量效关系，0.03%的迷迭香提取物抑制蛋白质氧化效果与异抗坏血酸钠相当。

3 结 论

本研究对迷迭香提取物在体外和萨拉米中抗氧化活性的各项指标进行测定，结果表明：迷迭香提取物在体外具有良好的清除DPPH自由基和活性氧自由基的能力以及还原力；适宜质量分数的迷迭香提取物可以有效抑制萨拉米加工过程中的脂肪氧化，并且效果优于合成抗氧化剂异抗坏血酸钠，其在抑制蛋白质氧化方面也与异抗坏血酸钠效果相当。因此可以考虑在萨拉米等发酵肉制品中将其用于替代合成抗氧化剂，以保证发酵肉制品的安全性。