重组蛋白检测肺炎支原体IgM抗体分析

陈曦 赵芝娜

【摘 要】目的：用重组肺炎支原体P1蛋白检测患儿血清中IgM抗体，探讨该重组蛋白抗原在肺炎支原体感染早期诊断中的应用价值。方法：被动凝集实验检测130例呼吸道感染患儿血清标本，从中选出35例阳性血清标本，用纯化的重组肺炎支原体P1蛋白做抗原，间接ELISA方法分别检测患儿血清中IgM和IgG抗体。结果：被动凝集实验检测阳性率为33.1 %（43/130）。间接ELISA试验 MpIgM抗体的阳性率为 91.4%（32/35） ，IgG抗体的阳性率为85.7%（30/35），两种抗体检出的阳性率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）且两者阳性符合率为93.3%。结论：重组肺炎支原体P1蛋白抗原检测IgM抗体提高了检测的特异性和敏感性，适用于肺炎支原体感染的早期诊断。

【关键词】肺炎支原体；重组蛋白；ELISA IgM抗体

【中图分类号】R375.1 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）04-0-01

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是引起小儿呼吸道感染的常见病原菌[1]，引起的非典型肺炎起病缓慢，病程较长，感染后引起的合并症复杂。由于对支原体分离培养困难而难以用于临床诊断，临床检测主要依靠血清学方法和PCR。由于Mp细胞膜上的糖脂抗原与其它微生物及机体组织存在交叉抗原，其刺激集体产生抗体可与人的血清发生非特异性反应。因此，血清学检测方法中所用诊断抗原的质量、检测方法及检测指标的不同可直接影响血清学检测结果的敏感性与特异性。有文献报道用构建的重组P1蛋白做抗原检测临床标本中IgG抗体显示出较好的特异性[2-3]。由于IgG抗体在体内持续时间长，需双份血清抗体滴度4倍以上升高才有诊断意义，不利于疾病的早期诊断。本研究用重组的肺炎支原体P1蛋白做抗原，ELISA检测临床标本中的IgM抗体，并与检测的IgG抗体及用肺炎支原体膜抗原被动凝集试验的检测结果进行比较分析，以评价肺炎支原体重组P1蛋白抗原检测IgM抗体在MP感染早期诊断中的应用价值。

1 材料与方法：

1.1 材料

35份阳性血清标本来自本院儿科门诊呼吸道感染患儿被动凝聚试验43例阳性标本中。10份正常人血清标本采自门诊健康人群。Mp FH P1重组蛋白抗原，P1蛋白免疫血清由中国医科大学王桂珍教授惠赠；被动凝集法Mp抗体检测试剂盒系富士瑞必欧株式会社产品（SEROIDR-MYCOⅡ） 。酶标二抗（兔抗人IgM-HRP，IgG-HRP抗体）购自Sigma-aldrich。

1.2 标本采集与保存

临床标本来源于本院儿科门诊2015年11 月至2016年11月 呼吸道感染患儿130例，年龄在2-10岁，抽取静脉血3ml，离心后分离血清，被动凝集实验测Mp抗体，被动凝集实验阳性标本的血清（1：80 以上）置-80℃冰箱保存。

1.3 被动胶乳凝集试验 参照试剂盒说明书方法进行。向第一孔加入100?l血清稀释液，第2-8孔各加25?l血清稀释液。向第一孔加入25?l待检血清，混匀后吸出25?l 加到第二孔，依此类推做倍比稀释。在第1孔加入未致敏粒子（鞣化的明胶粒子1：20）25?l，第2至8孔加入致敏粒子（肺炎支原体细胞膜抗原1：40）25?l，混匀，室温置3小时，严格按照说明书判定结果，将显示阳性（+）反应图像的最终稀释倍数作为抗体滴度。

1.4 间接ELISA检测患者血清中的IgM、IgG抗体 肺炎支原体P1蛋白抗原的纯化与定量参见文献[3]。采用方阵滴定法筛选出P1重组蛋白抗原的最佳包被浓度。参照文献[1]对10份正常人血清进行ELISA检测，测定光吸收值（OD492）。每块酶标板均设空白孔（PBS），阴性对照孔（正常人血清）及阳性对照孔（被动凝集效价大于1：160的血清标本），血清标本均做1：100稀释，并作双孔检测。根据计算出的平均OD值和标准差设定临界值。

用纯化肺炎支原体P1重组蛋白包被酶标板（含重组蛋白0.4ug/孔），加入1︰100 稀释的待检血清50 μl，置37 ℃水浴30 min，用洗涤液连续洗板5次，拍干，反应孔内加抗人Ig酶结合物（1：500 ）50 ?l，置37 ℃水浴30 min，洗板；每孔加入50 ?l底物液A和50 ?l底物液B，混匀，置37 ℃避光显色10 min；每孔加入50 ?l终止液，用酶标仪测吸光度A492值；结果判定：COV=阴性对照孔平均A492值×2.1倍。样品A492值S/COV≥1为阳性，样品A492值S/COV<1为阴性。

2 结果

2.1 被动凝集实验检测结果 在临床检测的130 份血清标本中，被动凝集实验判断为阳性标本43例，阴性标本76例，疑似病例（血清效价1：40）11例，检测阳性率为33.1 %。其中5岁以下儿童血清标本95例，血清阳性标本效价大于1：80的31例，1：40的8例。阳性率为32.6% 。6-10岁血清标本35例，阳性标本12例。阳性率34.3%

2.2 重组蛋白抗原间接ELISA检测血清中IgM、IgG结果 本研究选择了35份被动凝集实验血清效价在1：80-320倍的阳性血清，用纯化的P1蛋白做抗原，间接ELISA分别检测肺炎支原体IgM和IgG抗体。

用方阵滴定法筛选重组蛋白的最佳包被浓度，重组P1蛋白的浓度为4ug/ml，采用P/N比率法对结果进行判定：

P/N = 待检血清标本校正值 =待检血清OD值 / 阳性参照标本OD值

阴性标本平均校正值 = 阴性血清平均OD值 / 阳性参照标本OD值

P/N≥2.1时判断为阳性，P/N<2.1为阴性，对1.5≤P/N<2.1的标本按照同样检测条件重复检测，排除假阳性。10份正常人血清平均OD值为0.0607。根据判定标准（P/N≥2.1为阳性，P/N<2.1为阴性）可知，待检血清OD值0.1275（0.0607×2.1）以下为阴性，所测样本中最大OD值为0.0661，属于阴性，故10份正常人血清均为阴性，由此计算出的阴性血清标本平均校正值为0.4651。

3 讨论

病原菌感染后可刺激集体产生多种抗体，其中IgM抗体在血中出现早，消失快，往往被用做病原感染早期诊断的指标。但感染产生的IgM抗体有时是非特异性的，临床易出現假阳性反应。选用特异的抗原检测IgM抗体，则可提高检测的特异性。本研究用重组的P1蛋白抗原检测IgM抗体，由于其含有肺炎支原体特异的抗原表位[2]，因此可提高检测的特异性。本实验用重组蛋白检测10份正常人血清，没有出现阳性结果。本研究检测的130份临床标本被动凝集实验判断为阳性标本43例，检测阳性率为33.1 %。其中判定为阴性标本的病例中有11份可疑病例，血清效价为1：40 。我们选择了35例实验阳性患儿血清做被检测对象，检测阳性率为91.4%。对80例新生儿肺炎患儿进行IgM和IgG检测，感染一周后检测阳性率分别为97.5%和56.3%。

本实验中检测的IgM抗体略高于IgG抗体的检出率，可能原因是标本采集于门诊患儿，所选病例多数为5岁以下的儿童标本，标本采集时仍处于疾病的早期阶段。对于有过支原体反复感染的儿童，IgM抗体检出率会下降。Qu J等[5]对125例14-85岁疑似MP感染患者进行定量PCR、分离培养和血清学检测抗体，结果发现，三种检测方法在灵敏度、阳性预测值和阳性拟然比呈上升趋势，但IgM检测明显低于培养法和定量PCR。除检测方法的差异外，年长患者既往可能有过支原体感染，随时间延长血清中IgM减少而IgG持续存在。支原体在咽部的定植存在也可产生一定浓度的IgG抗体。本研究结果显示，应用重组蛋白做抗原，ELISA法检测患儿血清中的IgM抗体，可以用作小儿肺炎支原体感染的早期诊断。

参考文献

赵芝娜，王桂珍** 董占双 李保强。肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达。中国人兽共患病杂志，2005， VOL 21（6）：470-472. ISSN 1002-2694

宋焕景 王桂珍** 董占双 刘忠顺 吉兆华 周吉海 。肺炎支原体P1重组蛋白的提取纯化及应用研究。微生物学杂志，2007，27（3）：107-110