库尔勒香梨离体叶片再生体系的建立

钟 颖，冯建荣，樊新民 ，任欢喜，张秀抗，许竹叶

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】库尔勒香梨是新疆梨系统中最具代表性的优良品种，地域性极强，有1 400年栽培历史，享誉国内外市场[1]。香梨风味甜美，肉质细腻，酸甜可口，已成为重要的出口创汇农产品之一[2]。经过长期栽培实践，已育有一些优良品系，但香梨树普遍存在坐果率低、产量不稳定、品质下降等问题。常规育种预见性差、周期长、效率较低[3],利用遗传转化技术改良香梨品质及产量相关特性，为分子水平改良培育香梨品种提供了很好的育种策略。但香梨转基因育种进展缓慢，其主要原因是至今仍未建立有效的遗传转化体系，因此，库尔勒香梨叶片再生体系的建立，是进行其遗传转化的前期基础。【前人研究进展】梨离体叶片培养起步较晚，始于1988年。Laimer等[4]用西洋梨康弗伦斯(Conference)试管苗叶片做试验，在6-BA和IBA的共同作用下，部分愈伤组织能够形成球状结构，但仅有少量的球状结构转化成了不定梢。Abu-Qaoud[5]、Chevreau[6]、Predieri[7]等相继以几种梨试管苗的叶片为材料并成功诱导出不定梢，但再生率不高。Lelay等[8]于1991年在改变氮源比例的条件下，康弗伦斯不定芽再生率高达 96.7%。目前已经有康弗伦斯、小香(Seckel)、考密斯(Comice)、帕西(Passe Crassane)等[9]欧洲梨品种取得了成功。在东方梨中，砂梨的冀蜜、丰水、二十世纪(Nijisseiki)、Kosui、Shinchu[10]和白梨的水晶梨[11]、谢花甜梨[12]及金花梨[13]等品种有了不定梢再生的报道。近几年国内外对库尔勒香梨组织培养研究较少，目前有关库尔勒香梨组织培养主要集中在离体快繁技术方面。王建新等[14]以库尔勒香梨的茎尖作为外植体，比较了三种基本培养基(MS 培养基、改良 MS 培养基、1/2MS 培养基)对增殖的影响，结果发现以改良MS培养基的增殖率最高，达到 66.7%。刘晓婷[15]以库尔勒香梨叶片为外植体，是目前叶片诱导再生不定芽效率最高的，最佳的植物生长调节剂组合为1.0 mg/L TDZ 和0.5 mg/L NAA，叶片不定芽诱导率达到了77.78%。李致慧[16]指出库尔勒香梨生根培养基(1/2 MS)中，暗培养5 d，NAA 浓度为 0.3 mg/L时生根率最高，可达 52.4%，且根粗壮长势好，平均生根数是2.48。【本研究切入点】刘晓婷[15]沿用此生根配方，生根率达到 53%。研究建立库尔勒香梨叶片诱导再生的稳定高效再生体系。【拟解决的关键问题】以库尔勒香梨离体培养的继代30 d左右的无菌苗叶片为材料，1/2 MS为基本培养基，用 TDZ与 IBA或 NAA分别组合设计配方，研究不同生长调节剂质量浓度组合对不定芽诱导过程中愈伤组织形成率和不定芽形成率的影响，为完善库尔勒香梨再生体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用品种为库尔勒香梨，由新疆农科院轮台国家果树资源圃提供。3月底至4月初于资源圃采集一年生休眠枝条，将休眠枝条置于室内进行浸泡催芽，用于初代外植体的培养，参照实验室的消毒方法获得无菌苗[17]，以继代30 d左右的无菌苗叶片作为材料。

1.2 方 法

1.2.1 叶片诱导愈伤组织再生不定芽

库尔勒香梨叶片诱导不定芽选用 1/2 MS 培养基，1.0 mg/L的 TDZ 分别与 IBA (0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L)、NAA(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L)进行组合。共计14个配方，每个配方接种30 个外植体，重复3次。据文献[18]，使用 AgNO3有利于叶片再生不定芽，试验选取最优生芽配方再附加不同质量浓度的AgNO3(0、0.5、1 mg/L)继续优化，每个处理接种30个叶片，3次重复。

接种外植体均取离体培养的库尔勒香梨无菌苗中上部完整幼嫩叶片，除去叶柄，垂直于叶片中脉横切3～4刀，每片叶以远轴面接触培养基，先置于暗培养21 d后转移到光培养，每天进行观察记录，第30 d继代愈伤组织，在继代前统计愈伤组织，30 d后进行不定芽继代，继代前统计不定芽形成率，愈伤组织约0.5 cm2记为有效愈伤组织，小于则忽略不计；形成的不定芽芽尖冒出大于0.5 cm记为有效不定芽，小于则忽略不计。

试验光照强度均为 2 000 lx，温度为(25±2)℃，每个培养基中均添加 30 g/L蔗糖，6.5 g/L琼脂粉，pH 调至5.8。

1.2.2 诱导生根

选用1/2 MS培养基诱导香梨生根 ，为了保证用于诱导生根试验的不定苗状态相对一致，以继代4周的无菌苗为试材，选取的再生苗平均株高约2 cm，茎粗约0.2 cm ，分别接种到附加到 IBA(0.5 mg/L)和NAA(0.3、0.6 、0.7、0.9 、1.1 、1.4 mg/L)的6 组生根配方，每个处理接种30株无菌苗，3 次重复。暗培养7 d，每天进行观察记录，培养35 d后统计生根率及生根数和生根长度,生根长度约大于1 cm记为生根，小于1 cm忽略不计。

培养条件同上。

1.3 数据处理

结果采用SPSS数据分析软件处理数据，进行方差分析。

愈伤组织形成率% =形成愈伤组织叶片数/接种叶片数 ×100。

不定芽形成率%=再生芽总数/接种叶片数×100。

不定根再生率%=生根无菌苗数/接种无菌苗数×100。

平均生根数=总的生根条数/生根苗的数量。

平均生根长度=总的生根长度/总的生根条数。

2 结果与分析

2.1 1.0 mg/L TDZ与IBA或NAA组合对库尔勒香梨诱导叶片愈伤组织的影响

接种后4～5 d 可以看到有愈伤组织开始出现，10 d时，叶片边缘开始卷曲，叶片切伤处、叶柄端处开始长出少量浅黄色或浅白色愈伤组织(图1A)，20 d时，各配方处理的叶片产生的愈伤组织膨大增多，颜色呈黄白色。在暗培养21 d后，转至光培养，光培养5 d后愈伤组织开始由黄色向绿色转变，少量的愈伤组织上有绿色的芽点(图1B)。

研究表明，当TDZ浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织诱导率随IBA和NAA 浓度的增加呈先上升后下降的趋势。IBA浓度为0.5、0.6、0.7和0.8 mg/L愈伤组织诱导率较高，分别为100%、100%、97.78%、97.78%，这些配方之间生长效果差异不显著，但显著高于其他处理。IBA为0.9 mg/L组织诱导率最低，为87.78%，显著低于其他处理。 含NAA的配方组合的愈伤组织诱导率都很高，当NAA为0.4～0.8 mg/L愈伤组织诱导率均较高，为97.78%或100%，这些配方之间生长效果差异不显著，但显著高于其他处理。TDZ与含NAA的配方愈伤组织比TDZ与含IBA的配方愈伤组织的数量多、体积大、颜色更鲜绿。表1，图1

表1 TDZ 1.0 mg/L与不同浓度IBA或NAA组合下库尔勒香梨叶片再生变化
Table 1 Effects of TDZ 1.0 mg/L with different concentration of IBA or NAA on regeneration of Korla Fragrant Pear

处理Treatment 植物生长调节剂质量浓度Plant growth regulators(mg/L)IBANAA愈伤组织形态Callus shape愈伤组织形成率Frequency of callus formation (㐷SE) (%)不定芽形成率Frequency of shooting (㐷SE) (%)10.3淡黄色紧密体积小90±2.72de27.78±1.92g20.4淡黄色紧密体积小93.33±2.72cd41.11±1.92e30.5淡黄色紧密体积小100±0.00a74.44±1.92a40.6淡黄色紧密体积小100±0.00a71.10±5.09ab50.7淡黄色紧密体积小97.78±1.57ab71.11±1.92ab60.8淡黄色紧密体积小97.78±1.57ab66.67±5.09b70.9淡黄色紧密体积小87.78±1.57e61.11±1.92c80.3黄绿色紧密体积大95.55±1.57bc41.11±1.92e90.4黄绿色紧密体积大97.78±1.57ab47.78±1.92d100.5黄绿色紧密体积大97.78±1.57ab52.22±1.92d110.6黄绿色紧密体积大100±0.00a71.11±5.09ab120.7黄绿色紧密体积大100±0.00a36.66±3.33ef130.8黄绿色紧密体积大97.78±1.57ab32.22±1.92fg140.9黄绿色紧密体积大90±2.72de51.11±1.92d

注：表中数值后的字母表示邓肯氏新复极差法在P=0.05时检测的显著水平，下同

Note：Different letters behind numerical value in this Table shows significance by Duncan’s atP=0.05. The same as below

2.2 1.0 mg/L TDZ与IBA或NAA组合对库尔勒香梨愈伤组织诱导不定芽的影响

转入光下培养5 d,出现有绿色芽点，形状已明显不同于愈伤组织，愈伤组织继续分化，逐渐形成不定芽；30 d之后，不定芽大量形成，随后不定芽速度减缓。研究表明，当TDZ 浓度为1.0 mg/L时，不定芽形成率随IBA 和NAA 浓度的增加均呈先上升后下降的趋势。当 TDZ 为1.0 mg/L时，IBA 浓度为0.3 mg/L愈伤组织也会产生少量的不定芽，但不定芽再分化芽很少(图1F)，只有27.27%，显著低于其他处理；当IBA 为 0.5 mg/L时不定芽形成率较高(74.44%)且生长状况良好, 再生芽多为丛生芽(图1C)，与 IBA 为 0.6、0.7 mg/L时不定芽形成率差异不显著(图1D、E)；IBA 为0.8 mg/L时不定芽形成率达66.67%，与最好的配方差异显著。NAA为0.6 mg/L时，不定芽形成率较高且生长状况良好(图1G)，不定芽形成率达到最高，为71.11%，显著高于含NAA配方的其他处理。

综合不定芽形成率和再生芽的生长状态，确定库尔勒香梨叶片诱导再生不定芽的最优配方为1/2MS + TDZ 1.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L与1/2MS + TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.6 mg/L。表1，图1

2.3 不同质量浓度的AgNO3对再生不定芽形成率的影响

研究表明，附加AgNO3对不定芽再生的效果不一，含IBA的配方附加0.5 mg/L AgNO3叶片再生不定芽率有明显提高(图1H)，为84.92%，显著高于未添加AgNO3的再生芽率；附加1.0 mg/L AgNO3时，不定芽形成率显著低于未添加AgNO3的再生芽率，对不定芽的形成有抑制作用。但对含NAA的配方附加0.5和1.0 mg/L AgNO3没有促进不定芽的再生，其再生率反而低于未添加AgNO3的再生率(图1I)。表2，图1

A．10 d的再生愈伤组织;B.25 d的再生愈伤组织;C.接种在TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.5 mg/L培养基上的不定芽;D. 接种在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L培养基上的不定芽;E. 接种在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.7 mg/L培养基上的不定芽;F. 接种在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L培养基上的不定芽;G. 接种在TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.6 mg/L培养基上的不定芽;H. 接种在TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L培养基上的不定芽;I. 接种在TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L培养基上的不定芽;J.刚接种在生根培养基的无菌苗 K. 35 d 无菌苗在生根培养基的生长情况;L. 接种在IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L不定根再生;M. 接种在IBA 0.5 mg/L + NAA 0.6 mg/L不定根再生;N. 接种在IBA 0.5 mg/L + NAA 0.9 mg/L不定根再生;O. 接种在IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.7 mg/L不定根再生;P. 接种在IBA 0.5 mg/L+ NAA 1.1 mg/L不定根再生

A.10 days’ regeneration of the tissue ; B. 25 days’ regeneration of the tissue; C. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L medium; D. Adventitious bud inoculated in regeneration of the tissue in TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.6 mg/L medium; E. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.7 mg/L medium ; F. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L medium ; G. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L medium ; H. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L medium ; I. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L medium; J. A seedless vaccine that was first inoculated in a growing medium; K. The growth condition of the aseptic seedlings in the rooting medium for 35 days; L. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L medium; M. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.6 mg/L medium; N. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.9 mg/L medium O. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.7 mg/L medium; P. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 1.1 mg/L medium

图1 A-P库尔勒香梨叶片诱导再生愈伤组织、再生不定芽、生根情况
Fig.1 A-P are the regeneration of the tissue of the Korla pear, the regeneration of the bud and the root condition

表2 不同浓度 AgNO3和最优配方组合下库尔勒香梨叶片再生不定芽变化

Table 2 The influence of different concentrations of AgNO3and the optimal formula on the regeneration of the leaf regeneration of the Korla pear

处理Treatment浓度 Concentration(mg/L)TDZIBANAAAgNO3不定芽形成率Frequency of adventitious bud formation(㐷SE) (%)110.5075.55±1.92b 210.50.584.92±1.92a 310.5165.55±1.92c410.6072.22±1.92b 510.60.541.11±1.92e610.6156.67±3.33d

2.4 0.5 mg/L IBA 和不同质量浓度的NAA 对库尔勒香梨再生无菌苗生根的影响

研究表明，当 IBA 浓度为0.5 mg/L时，生根率、平均生根数量和平均根长度均随着NAA 浓度的升高呈先升高后降低的趋势。当NAA 浓度为 0.3 mg/L时，生根率显著低于其他处理，为7.5%(图1L)；随着NAA 浓度增加，生根率也显著提高(图1O)，当NAA达到0.9 mg/L时，生根指标均达到峰值，再生苗的生根率为100%，显著高于其他处理；平均生根数量5.66根，平均生根长度2.8 cm，且根系较其他处理更粗壮(图1N)；当NAA浓度继续增加时，平均生根数量及根长又显著下降(图1P)。图1，表3

表3 0.5 mg/L IBA和不同NAA浓度下库尔勒香梨无菌苗生根变化
Table 3 The effect of 0.5 mg/L IBA and different NAA concentration on rooting of Korla pear seedlings

处理Treatment植物生长调节剂质量浓度Plant growth regulators( mg/L)生根率Rotting rate(㐷SE)(%)平均生根数(株)No.of roots (㐷SE) 平均根长度(株)Length No.of roots(㐷SE) (cm)IBANAA10.50.37.5±0.02f3.1±1.24ab1.2±0.24b20.50.630±0.03e3.8±1.39ab1.34±0.38b30.50.788.9±0.02b5.06±1.98ab1.41±0.47b40.50.9100±0.00a5.66±1.46a2.8±0.66a50.51.166.7±0.03c2.53±1.82b2.45±0.96a 60.51.450±0.03d2.44±2.21b1.0±0.85b

3 讨 论

刘晓婷[15]在库尔勒香梨叶片诱导不定芽再生中分别比较NN69、MS、1/2MS和1/4 MS四种基本培养基，NN69 + 6-BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+山梨醇20 g/L+琼脂 7 g/L，叶片再生率可高达 66.55%，显著优于其他基本培养基，提出NN69基本培养基是影响库尔勒香梨叶片再生的最关键因子。在其他的梨品种上，如苹果梨[19]和满园香梨[20]也有研究提出NN69基本培养基对叶片生芽最好。试验采用1/2 MS 基本培养基，附加1.0 mg/L TDZ + 0.5 mg/L IBA + 0.5 mg/L AgNO3，叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽，其不定芽形成率可以达到84.92%。表明1/2 MS基本培养基也适合诱导库尔勒香梨叶片再生。

试验中发现AgNO3浓度为 0.5 mg/L与TDZ和IBA组合，有利于库尔勒香梨叶片愈伤组织诱导不定芽，秦璐等[21]在库尔勒香梨叶片诱导不定芽再生中也有相似结果。另外试验中在AgNO3与TDZ和NAA组合时，没有促进库尔勒香梨叶片愈伤组织诱导不定芽。但前人在金花和苍溪两个梨品种的叶片诱导不定芽中[22]，发现在培养基NN69+NAA0.2 mg/L+BA3 mg/L附加AgNO3在0～4 mg/L浓度范围内都对金花不定芽再生有明显的促进作用；苍溪在附加AgNO30～8 mg/L浓度范围时都表现出了对不定芽再生的促进作用。说明在金花和苍溪两个梨品种的叶片诱导不定芽中含NAA的配方附加AgNO3对叶片诱导再生不定芽有促进作用。与试验研究结果有差异或许是外植体基因型不同造成。目前IBA、NAA对植物促进叶片不定芽再生的机制也未明确的研究结论，所以其与AgNO3如何互作在不定芽诱导中发挥作用还需要更进一步的研究。

4 结 论

当TDZ 浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织形成率和不定芽率随 IBA 的质量浓度升高先增加后下降，在0.5 mg/L IBA 时愈伤组织形成率和不定芽形成率均为最高值，愈伤组织形成率均为100%，不定芽形成率为74.44%；同样TDZ 浓度时，愈伤组织形成率和不定芽率随 NAA 的质量浓度也呈现先上升后下降的趋势，在0.6 mg/L NAA时愈伤组织率达到100%，不定芽形成率达到71.11%。在两个优选配方中添加0.5 mg/L AgNO3时，TDZ为1.0 mg/L，IBA 为0.6 mg/L时，不定芽形成率达到84.92%；而TDZ 和NAA组合的配方添加AgNO3不定芽形成率并没有提高。在暗培养7 d，IBA 为0.5 mg/L时，生根率随着 NAA 浓度的升高呈先升高后下降的趋势，在浓度为0.9时达到峰值，为100%，平均生根条数为5.66，平均根长度为 2.8 cm。

库尔勒香梨叶片诱导不定芽再生的最佳培养基为1/2 MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AgNO30.5 mg/L，愈伤组织诱导率100%，不定芽形成率84.92%。最适宜香梨再生苗生根的培养配方是：1/2 MS + 0.5 mg/L IBA + 0.9 mg/L NAA，结合前期暗培养7 d，生根率可达100%。建立并优化了库尔勒香梨的再生体系，为梨的遗传转化研究奠定基础。