加速溶剂萃取法提取蛹虫草主要成分工艺优化分析

陈方圆，马麦燕，张相锋，马正海，焦子伟

(1.伊犁师范学院生物与地理科学学院，新疆伊宁 835000；2. 新疆大学生命科学学院，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】蛹虫草(Cordycepsmilitaris)是一种珍贵的药(食)用真菌，又名北冬虫夏草、北虫草等，主要有虫草素、腺苷等成分组成。虫草素(Cordycepin)具有抗菌性[1-2]，抗肿瘤[3]，在促进脾脏质量增加，提升肝脏核酸、蛋白质更新速度等方面也有一定的作用[4-5]。腺苷(Adenosine)也是核苷类的一种，其具有抑制中枢神经递质的释放、改善心脑血液循环等作用[6-7]。【前人研究进展】加速溶剂萃取仪(accelerated solvent extraction, ASE)[8-12]，是利用溶剂对固体、半固体的样品进行萃取[13]。近几年，在国内外均有利用ASE提取天然活性成分的研究，但提取蛹虫草主要成分虫草素、腺苷等未见相关报道[14-19]。其原理是在高温、高压条件下，溶剂粘度降低，分子运动能力提高，使溶质和溶剂分子能够迅速渗出，并且溶质分子更易挣脱基质的约束。ASE 技术一般将目标分析物在20 min内自动从样品中完成提取，可取代超声萃取、微波萃取、索氏提取、煮沸法等传统方法。【本研究切入点】ASE有节约溶剂[20]、耗时短、操作简单、提取效果佳等优点，且在试验后期上HPLC检验目标分析物时，所获得的提取液无需再次进行浓缩、净化等过程，直接定容、过膜即可进样分析，简短样品的前处理时间。研究加速溶剂萃取法提取蛹虫草主要成分工艺优化。【拟解决的关键问题】选择该技术提取蛹虫草两种主要成分虫草素和腺苷，并采用正交试验法进行提取工艺条件优化。得到加速溶剂萃取法提取虫草素、腺苷最优条件，为选择最佳提取新疆地区蛹虫草主要活性物质虫草素、腺苷方法提供技术样本。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试剂

乙醇(C2H50H)，色谱纯级乙腈(C2H3N)，ddH2O等。蛹虫草子实体来自本实验室蛹虫草人工栽培基地；虫草素、腺苷标准品均购自北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.1.2 仪器设备

LC-20AB高效液相色谱仪(日本岛津)、ASE加速溶剂萃取仪(戴安中国有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采取正交试验，即四因素三水平进行优化，乙醇浓度分别是：0、20%、40%。萃取温度70、100、130℃，循环次数分别是：1、2、3，静态萃取时间5、10、15 min，计9个处理。表1

表1 ASE法提取虫草素、腺苷正交试验处理
Table 1 Orthogonal experiment ofthe exrtration of cordycepin and adenosine in ASE

处理Treatments温度(A)Temperature (A) (℃)时间(B)Time (B) (min)乙醇浓度(C)Ethanol concentration (C) (%)循环次数(D)Cycles (D) (次)170501270102023701540341005203510010401610015027130540281301003913015201

1.2.2 虫草素标准溶液配制

虫草素、腺苷标准品各取10 mg，用流动相定容至100 mL，摇匀。分别取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL母液(100 μg/mL)定容至10 mL，制备不同标准曲线浓度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL；并放置4℃冰箱备用。

1.2.3 加速溶剂萃取

将干燥的蛹虫草子实体放入粉碎机中粉碎1 min，过60目的细筛，将样品充分混匀后分别称取蛹虫草粉末9份4 g，与硅藻泥1∶1混匀，萃取剂选择乙醇，按表1的处理进行ASE萃取，分别收集提取液，离心4 000 r/min，10 min，提取液过0.22 μm滤膜后供HPLC检测用。

1.2.4 HPLC检测

检测条件：色谱柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈∶水(5∶95)；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL；波长：260 nm紫外检测器检测。

将不同梯度的虫草素和腺苷标准品溶液，通过标样峰面积制成标准曲线。将被测提取液分别进行HPLC检测，依据标准曲线计算各处理样品的虫草素和腺苷的含量。

1.2.5 计算公式

样品中虫草素或腺苷的量以质量分数ω计，单位以毫克每千克(μg/g)表示，按式(1)计算。

ω=A×ρ×ν×f/(A×m).

(1)

1.3 数据处理

研究数据处理分析采用EXCEL数据整理和SPSS统计分析软件(Version 11.5，USA)进行数据处理及和正交分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

分别称取虫草素、腺苷标准品不同浓度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL各10 μL进样分析，依据标准曲线确定线性范围，得出虫草素的线性回归方程为Y=32.241X-1.2731，相关系数R=0.999 9；腺苷的线性回归方程为Y=33.443X-9.066 4，相关系数R=0.999 4。表2

2.2 HPLC检测虫草素、腺苷色谱图

研究表明，A 图为虫草素、腺苷标准品的色谱图，B至J图为各处理的色谱图，各图中峰a为腺苷的色谱峰，峰c为虫草素的色谱峰。可以清晰看出提取色谱图中虫草素、腺苷实现了基线分离，而且出峰时间控制得比较好。虫草素、腺苷标样的保留时间分别为7.016和9.308 min，虫草素的出蜂时间比腺苷的要晚，九个处理中均产生虫草素及腺苷，尤其是以虫草素为主，但因各个处理的条件不同，而产生虫草素、腺苷的量各不相同。图1

表2 虫草素、腺苷的标准曲线
Table 2 Standard curves of cordycepin and adenosine

线性回归方程Linear regression equation相关系数Correlation coefficient虫草素CordycepinY=32.241 X-1.273 1R=0.999 9腺苷AdenosineY=33.443 X-9.066 4R=0.999 3

注：A标样；B处理1；C处理2；D处理3；E处理4；F处理5；G处理6；H处理7；I处理8；J处理9，a腺苷；c虫草素

Note: A, standard samples; B, treatment 1; C, treatment 2; D, treatment 3; E, treatment 4; F, treatment 5; G, treatment 6; H, treatment 7; I, treatment 8; J, treatment 9. a, Adenosine; c, Cordycepin

图1 HPLC检测虫草素、腺苷色谱
Fig.1 HPLC detection of cordycepin, adenosine chromatogram

2.3 虫草素提取

研究表明，九组处理得到虫草素含量各不相同，其中以处理7提取的虫草素含量最高，为5 611.898 μg/g，处理1、2、3、4、9、5提取的虫草素含量较低，处理8提取的虫草素含量最低，为3 360.243 μg/g。从虫草素提取结果和正交试验效应分析可得，4个因素影响虫草素提取率的主次顺序为：萃取时间>乙醇浓度>循环次数>萃取温度，正交分析最优组合为A1B1C2D2。即温度70℃，时间5 min，乙醇浓度20%，循环次数2次。表3，图2

表3 加速溶剂萃取法提取虫草素结果
Table 3 The results of accelerated solvent extraction extraction of cordycepin(μg/g)

处理Treatment温度Temperature(℃)时间Time(min)乙醇浓度Ethanol concentration(%)循环次数Cycles(次)虫草素含量Cordycepin content(μg/g)1705014 446.905270102025 302.780370154034 984.793410052035 361.7935100104013 556.886610015024 054.333713054025 611.898813010033 360.2439130152014 431.650均值1 Mean value 14 911.495 140.23 953.834 145.15均值2 Mean value 24 324.343 458.565 032.074 833.12均值3 Mean value 34 467.934 310.964 717.864 568.94极差 Range587.151 681.641 078.24687.97最优水平 Optimal evelA1B1C2D2

图2 加速溶剂萃取法提取虫草素正交试验结果效应
Fig.2 Effect of orthogonal experiment ofaccelerated solvent extraction extraction of cordycepin

2.4 腺苷提取

研究表明，九组处理得到腺苷含量也各不相同，以处理8提取的腺苷含量最高，为740.351 μg/g；处理6的次之，处理2、3、4、5、7、9所取的含量较低，处理1提取的腺苷含量最低，为29 μg/g。从腺苷提取结果和正交试验效应分析可得，4个因素影响腺苷提取率的主次顺序为：乙醇浓度>萃取时间>循环次数>萃取温度，正交分析最优组合为A2B2C1D2。即温度100℃，时间10 min，乙醇浓度0，循环次数2次。表4，图3

表4 加速溶剂萃取法提取腺苷结果
Table 4 The results of accelerated solvent extraction extraction of adenosine

处理Treatment温度Temperature(℃)时间Time(min)乙醇浓度Ethanol concentration(%)循环次数Cycles(次)腺苷含量Adenosine content(μg/g)17050129.00027010202524.1637015403145.5741005203218.272510010401156.49261001502738.8527130540297.09081301003740.351913015201119.237均值1 Mean value 1232.910114.787502.734101.576均值2 Mean value 2371.205473.668287.223453.367均值3 Mean value 3318.893334.553133.051368.064极差 Range138.295358.881369.683351.791最优水平 Optimal evelA2B2C1D2

图3 加速溶剂萃取法提取腺苷正交试验结果效应
Fig.3 Effect of orthogonal experiment of accelerated solvent extraction extraction of adenosine

3 讨 论

加速溶剂萃取法是近些年新出现的一种新型提取方法，其原理和CO2超临界萃取仪相似，该方法更具有操作流程简单、全自动、溶剂用量少、时间短、材料前、后期处理简便等优点[21]。目前不少学者利用加速溶剂萃取法得到了生物碱、苷类等物质，赵恒强等[22]用此法从黄连中提取黄连素(盐酸小檗碱)并用正交试验对实验条件优化，确定该方法适合提取黄连内的生物碱，最佳提取条件是：温度130℃，80% C2H5OH+0.5% HCl 作提取溶剂，静态提取10 min，提取1次；石矛等[23]得到人参总皂苷，确定最佳工艺参数：提取温度140℃，提取时间5 min，循环次数3次；徐夏叶等[24]研究对甜叶菊中的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙C、甜菊甙的提取效果，最佳条件是：水作为溶剂，压力1.03×107Pa ，静态萃取10 min，温度60℃，循环2次。目前用此方法提取虫草素、腺苷的研究很少。试验利用加速溶剂萃取法成功提取得到了虫草素、腺苷，并对提取条件进行了优化。试验提取腺苷的最优条件是：温度100℃，时间10 min，乙醇浓度0，循环次数2次，虫草素的最优条件是：温度70℃，时间5 min，乙醇浓度20%，循环次数2次。此结果和以上学者提取苷类最优条件相差不大，主要是因为苷类这类物质结构相似，都是由糖基和非糖基(苷元)构成；溶剂主要使用的是水，因为提取的这类物质糖基多，苷元所占比例较少，亲水性增加，在水中的溶解性也较强的缘故。该技术与传统提取虫草素、腺苷方法相比也具有明显优势，它是利用高压、高温的条件下，快速从蛹虫草中提取出来，并且会使虫草素在溶剂中的溶解度和溶出速率大大提高，提取效率增高。加速溶剂萃取虫草素、腺苷的研究，为提取虫草素、腺苷增加了选择方法，但该技术还需做更多的摸索尝试，有待进一步做深入研究。

4 结论

通过加速溶剂萃取法提取蛹虫草两种主要成分虫草素和腺苷，采用正交试验法进行了提取工艺条件优化，得到了加速溶剂萃取法提取虫草素、腺苷最优组合条件。4个因素影响虫草素提取率的主次顺序为：萃取时间>乙醇浓度>循环次数>萃取温度，加速溶剂萃取法提取虫草素的最适条件是：温度70℃，时间5 min，乙醇浓度20%，循环次数2次。4个因素影响腺苷提取率的主次顺序为：乙醇浓度>萃取时间>循环次数>萃取温度，加速溶剂萃取法提取腺苷的最适条件是：温度100℃，时间10 min，乙醇含量0，循环次数2次。