棉秸秆纤维素降解菌系构建及固体发酵条件优化

侯 敏，包慧芳，王 宁，詹发强，杨文琦，侯新强，杨 蓉，龙宣杞，崔卫东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆饲草短缺是限制饲料产业健康快速发展的瓶颈，利用我区现有资源，开发新型优质饲料原料，是今后饲料研究的重点领域。棉花是新疆的支柱性产业之一，种植面积约占全国的1/3，棉秆资源相当丰富。将棉秸秆资源转化成为粗饲料，木质纤维素是最大的限制因素之一，其紧密的晶状结构[1]很难降解。棉秸秆中纤维素含量占41.0%～42.0%，木质素占15.0%～25.0%，半纤维素占17.0%～21.0%，如果解决棉秆纤维素降解难题，将对新疆畜牧业发展及提高秸秆转化利用率具有积极的现实意义。【前人研究进展】目前，通常用化学、物理、生物方法处理秸秆[2]。利用有益微生物[3]降解处理秸秆，能促进纤维素或木质素的解聚[4]，提高粗饲料的营养价值。自然状态下彻底降解植物棉秆要充分重视多种生物之间的协同效应。魏如腾[5]证明复合菌降解秸秆的效果比单一菌种要好，纤维素降解率达到34.8%。复合系由多种处于协同关系的微生物组成，其反应产物互相利用和中和，形成了较稳定的自然循环系统[6]。崔宗均等[7]保持自然界中菌种之间的协同关系，筛选到了一组能够快速高效分解水稻稻秆的复合菌系。Kato等[8]通过研究复合菌系中主要菌株间的关系，将纤维素降解菌和非纤维素降解菌株组合在一起，发现非纤维素降解菌对纤维素降解菌起了非常重要的作用。【本研究切入点】结合国内外关于秸秆饲料化研究成果及理论，已得到一批提高棉秆发酵品质的菌株[9-10]。其中有产朊假丝酵母 (Candidautilis)、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)、粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)、地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)等。着眼于棉秸秆饲料化的难点：木质纤维素，筛选适用的纤维素降解菌，并结合已筛选得到的提高发酵品质的菌株，构建一组结构和功能稳定、对外环境变化抗逆性强、提高适口性的降解复合菌剂。【拟解决的关键问题】通过微生物预处理棉秸秆，研究棉秸秆中纤维素降解，为高效降解复合菌剂在棉秸秆饲料化中的开发利用提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秸秆

由新疆宏瑞达纤维有限公司提供，棉秸秆进行揉丝处理，切割成2.0 cm左右，用于发酵。

1.1.2 样品

棉花种植地土壤；牛、羊、骆驼新鲜粪便。

1.1.3 菌株

产朊假丝酵母(Candidautilis)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)等菌株有新疆农业科学院微生物应用研究所提供。

1.1.4 培养基

NA培养基见《微生物学实验技术》[11]。

刚果红纤维素琼脂培养基[12]：结晶纤维素 1.880 g，KH2PO40.500 g，明胶 2.000 g，MgSO40.250 g，琼脂 14.000 g，刚果红 0.200 g，蒸馏水1 000 mL，在121℃、101 kpa下灭菌15 min。

复筛液体培养基：NaNO30.500 g，滤纸(用1.000% CH3COOH溶液浸泡)5.000 g，KCl 0.500 g，CaCl 0.005 g，K2HPO41.000 g，CuSO40.050 g，FeSO4.7H2O 0.050 g，MgSO40.500 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0，在121℃、101 kpa下灭菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 纤维素降解菌的平板初筛

分别称取样品各10.000 g，在 90 mL无菌生理盐水中充分混匀，30℃、120 r/min，摇床培养30 min，吸取1 mL样品至 9 mL无菌蒸馏水的试管中，稀释梯度依次为10-2、10-3、10-4，吸取100 μL涂布于刚果红纤维素琼脂培养基上，放置生化培养箱，30℃，培养2～5 d。待菌生长后，将菌株分别点接到刚果红纤维素琼脂培养基上，放置生化培养箱，30℃，培养5 d。用1 M NaCl浸泡30 min，洗脱。测量透明圈直径，计算酶相对比活力：A=水解圈直径/天数。将酶相对比活力较高的菌株转接至NA培养基斜面上，30℃恒温培养24～48 h，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 纤维素酶活力测定

将酶相对比活力较高的菌株制备菌悬液，取 10 mL，12 000 r/min，离心10 min，上清液即为粗酶液。

内切葡聚糖酶(CMCase)活力测定[13]：取 2 mL 羧甲基纤维素溶液于 25 mL 刻度试管中，加 0.100 mL 粗酶液，混合均匀，50℃，水浴20 min后，再加入 3 mL DNS 试剂，沸水浴10 min，定容25 mL，在520 nm 下测定其吸光值(A520)。酶活力计算：以每1 min 产生1 μmol 还原糖定义为1 个酶活力单位(U)。对照组为 100℃水浴灭活 5 min 的粗酶液。

滤纸酶(FPA)活力测定[14]：取0.500 mL 粗酶液，加入 2 mL 醋酸缓冲液和1条滤纸(经酸处理)于25 mL刻度试管中，50℃ ，水浴1 h后，往试管里加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min，定容25 mL，在520 nm下测定其吸光值(A520)，酶活力计算：以每 1 min 产生 1 μmol 还原糖定义为1个酶活力单位(U)。对照组为100℃水浴灭活5 min的粗酶液。

1.2.3 菌株的分子鉴定

采用美国ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM试剂盒提取菌株基因组。利用通用引物扩增细菌16s rDNA或真菌18s rDNA。PCR扩增反应体系为30 μL，含有10 μL premixTaq，上下游引物各0.500 μL，模板1 μL，无菌水12 μL。16s rDNA扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min；18 s rDNA扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成。将得到的测序序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，用ClustalX 软件和 MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法构建系统进化树。

1.2.4 菌株复配

将酶活力最高的菌株M22与提高秸秆发酵品质的产朊假丝酵母(Candidautilis)J1，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同配比液体摇瓶发酵，30℃，120 r/min，摇床培养 5～7 d后测定酶活力。表1

表1 混菌混合配比试验设计
Table 1 The design of mix strain rate

试验组The experimental groupJ1J2J3M22①1111②2111③1211④1121⑤1112⑥---1

1.2.5 棉秸秆固体发酵优化

以粉碎至长2 cm左右的棉秸秆为底物，进行固体发酵实验。以纤维素降解率为指标，以初始加水量、接种量、发酵时间为因素，利用Design-Expert.V8.0.6.1软件设计二次回归中心组合试验，拟合自变量与响应值之间的函数关系。响应面试验因素及水平设计。表2

1.2.6 棉秆发酵饲料化学成分含量测定含量测定

采用范式( Van Soest) 纤维测定法测定发酵饲料中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素含量[15]。纤维素降解率(%)=(原始棉秸秆中纤维素含量/处理后棉秸秆中纤维素含量)×100%

表2 响应面实验因素及水平设计
Table 2 The design of cotton solid fermentation experiment

因素Factor水平 Level-101初始加水量(%) Initial water addition607080接种量(%) Inoculation amount51015发酵时间(d) Fermentation time202530

1.3 数据处理

结果采用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行数据处理和分析，确定棉秸秆固体发酵最优试验条件。

2 结果与分析

2.1 纤维素高效降解菌株的筛选

2.1.1 纤维素降解菌株的分离筛选

从粪便及土壤样品中分离出能在刚果红纤维素琼脂培养基上产透明圈的菌株24株。图1

图1 部分菌株在刚果红纤维素琼脂平板上产生的透明圈
Fig.1 Transparent circle of strains in congo red cellulose agar plate

2.1.2 菌株纤维素酶活力直观评价结果

将菌株分别点接到刚果红纤维素琼脂培养基上，利用游标卡尺测量透明圈直径，并计算酶相对比活力：A=水解圈直径/天数。得到纤维素降解菌产纤维素酶能力的直观评价结果。从透明圈测定结果中可以看出，透明圈直径与菌落直径的比例最大值是6.200，为菌株 M22。表3

表3 纤维素分解菌的分解纤维素能力及产酶能力直观评价
Table 3 Evaluation of the enzyme producing capacity of the celluloses-degrading microbes

序号The number样品来源The sample sourceD(mm)d(mm)Dd(mm)A值The value of AM1羊粪2.1211.5211.3920.423M2羊粪9.8021.8825.2131.961M3羊粪8.3022.4833.3511.663M4羊粪3.4811.9821.7600.692M5牛粪8.2442.1613.8141.647M6牛粪2.0621.6241.2720.413M7羊粪7.4212.3803.1211.481M8牛粪6.5841.9623.3611.314M9土壤4.4230.9414.7010.885M10羊粪7.0002.7002.5901.401M11羊粪13.2608.4411.5712.650M12牛粪11.0311.9605.6322.205M13骆驼粪1.9811.2021.6520.393M14堆肥饲料2.8832.2031.3110.572M15骆驼粪2.2421.6841.3320.442M16羊粪3.5002.0611.7030.701M17牛粪2.1011.4221.4840.421M18牛粪2.3221.6611.4010.460M19土壤6.8811.9473.5521.371M20土壤5.4672.3822.2941.090M21土壤9.4082.3214.0521.881M22土壤11.0411.7886.2012.205M23土壤8.3041.9014.3751.666M24骆驼粪0.8800.6851.2910.174

注: d 表示菌株菌落直径；D 表示水解圈直径；D/d 表示水解圈直径与菌落直径的比值。天数均为5 d

Note: d: Diameter of the strains colony; D: Diameter of the hydrolytic circle; D / d: Ratio of the hydrolytic circle and the strains colony. The number of days are all 5 d

2.1.3 CMC酶和FPA酶活力的测定

对透明圈直径较大的10 株菌株进行酶活力测定，在540 nm处。表4

表4 不同含量葡萄糖对应的吸光光度值
Table 4 Opticald ensity of the different content glucose

葡萄含量Grape content(mg/mL)020406080100120140OD值The value of OD00.0110.0670.1440.2000.2600.3210.404

绘制出的葡萄糖标准曲线。

研究表明，回归直线方程线性公式为y=0.003x-0.033，y为吸光度(OD)值，x为还原性糖浓度(mg/mL)，补偿参数为0.033，R2=0.985 7，标准曲线相关性好，公式成立。根据方程式中函数，计算出葡萄糖物质量。图2

不同的菌株之间FPA酶活力有明显差异，其中酶活力最强的菌株是M22、M12、M2和M10，酶活力分别为9.699、8.447、7.457和7.283 U/h；不同菌株间的CMC酶活力也有明显的差异，酶活力最强的是M22，其次是M12、M2和M10，分别为10.435、8.876、8.550和8.433 U/h。综合结果，筛选出菌株M22做后续实验。表5

图2 葡萄糖标准曲线
Fig.2 Glucose standaed carve

表5 菌株FPA、CMC酶活力测定结果
Table 5 Enzyme activity determination results of strains

菌株编号Strain number滤纸酶活Filter paper activity(U/h)羧甲基酶活(U/h)Carboxymethyl cellulase activity(U/h)M27.4578.550M33.3935.113M55.7815.349M73.9644.744M107.2838.433M128.4478.876M195.5587.228M216.4396.904M229.69910.435M236.8138.100

2.2 降解菌株的分子鉴定及系统发育

根据菌株筛选及酶活力测定实验，得到一株细菌。采用ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM试剂盒提取菌株基因组，16S rDNA PCR 扩增产物，测序后，进行相似性分析，发现序列与 M22 相似性最高的菌株均属于Bacillus属, 其中与Bacillussp.cp-24(KY041855)处于最小分支，是Bacillussp. cp-24(KY041855)的近似种，相似性达到 99%，利用MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法构建系统进化树。菌株 M22的遗传距离与枯草芽孢杆菌(Bacillusubtilis)遗传距离最近，可将菌株 M22 定为枯草芽孢杆菌(Bacillusubtilis)。图3

图3 菌株系统发育树
Fig.3 Cladogram of antagonistic strains

2.3 混菌最优实验配比

将酶活力最高的菌株M22与提高秸秆发酵品质的产朊假丝酵母(Candidautilis)J1，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同比例设计实验，混合菌液体发酵实验结果。从试验结果看出，实验组③的酶活力最高，此实验组的混合比例是J1∶J2∶J3∶M22=1∶2∶1∶1，FPA酶活力为 19.420 U/L，CMC酶活力为 20.354 U/L，最终，选出第③实验组做后续实验。表6

表6 混菌混合配比试验结果
Table 6 The results of Mixed fungus mix ratio test

实验组Experience group滤纸酶活Filter paper activity(U/h)羧甲基纤维素钠酶活Carboxymethyl cellulase activity(U/h)①11.41314.534②15.61616.710③19.42020.354④14.83117.144⑤16.44418.522⑥10.73610.850

2.4 棉秸秆固体发酵纤维素降解条件优化

2.4.1 模型建立

采用3因素3水平响应面进行分析，研究初始加水量、接种量、发酵时间三个因素交互作用以及各因素对纤维素降解率的影响。试验设计，各因素水平编码见表2。经Design-Expert.V8.0.6.1软件对实验结果进行回归统计分析，见表6。根据表6的试验结果，以试维素降解率为Y值为响应值，得到如下回归方程：

Y=18.41+5.47×X1+1.91×X2+4.11×X3+1.16×X1×X2+4.02×X1×X3+0.14X2X3+1.16X12-0.67×X22-0.71X32。决定系数R2=0.973 8，说明方程拟合度好，表明预测值能与试验值具有高度相关度[16]，可用该方程进行方差分析和显著性检验。方差分析结果表明“Model Prob>F”等于 0.000 1 远小于 0.05，说明模型是显著的。在模型各参数中，接种量X1、发酵时间X2、初始含水量X3、二次交互项X1X3对纤维素降解率有极显著(P<0.01)影响。依据系数接种量X1=5.47、发酵时间X2=1.91、初始含水量X3=4.11，可知因素的主效应关系为接种量X1> 发酵时间X2> 初始含水量X3。表7

表6 棉秆纤维素降解率响应面试验设计及结果
Table 6 The chemical composition content determination result of fermented cotton feed

实验组Experience groupA:接种量A: Inoculation amount(%)B:发酵时间B: Fermentation time(d)C:初始含水量C: The initial moisture content(%)纤维素降解率The cellulose degradation rate(%)115307027.420210257018.070310306014.68045256011.98055207012.730610206012.440715258033.79085258013.440910257018.0701010257018.1101110257017.9801215207019.9601310307017.960145307015.5301515256016.2401610208019.1101710257019.840

表7 二次响应面回归模型方差
Table 7 ANOVA of the regression model of quadratic response surface

方差来源Source自由度df平方和Sum of Squares均方Mean SquareF 值F ValuePr>FP-valueModel9483.1353.6828.930.000 1X1-水分 X1-Moisture1239.04239.04128.83<0.000 1X2-接种量 X2- Inoculation Amount129.2629.2615.770.005 4X3-发酵天数 X3-Fermentation Time1135.38135.3872.96<0.000 1X1X215.435.432.930.130 9X1X3164.7264.7234.880.000 6X2X310.0780.0780.0420.843 0X1215.685.683.060.123 6X2211.871.871.010.349 3X3212.142.141.150.318 3残差 Residual712.991.86失拟 Lack of Fit310.443.485.460.067 4纯粹误差 Pure Error42.550.64合计 Cor Total16496.12

2.4.2 响应面交互作用分析与优化

图形能够提供一种形象的观测响应值和试验参数水平关系的方法[17]。等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著[18]。通过二元回归方程做响应曲面图和等高线图。当发酵时间和接种量处于最佳水平时，发酵时间和接种量的交互作用，随着接种量增加，纤维素降解率上升；随着发酵时间增加，纤维素降解率有上升趋势，说明发酵时间和接种量存在显著的交互作用，且接种量轴向等高线变化密集，发酵时间轴向等高线变化相对稀疏，故接种量对响应值峰值的影响较发酵时间影响大；当初始含水量和接种量处于最佳水平时，交互作用，随着初始含水量增加，纤维素降解率平稳上升，随着接种量增加，纤维素降解率逐渐上升，接种量轴向等高线变化密集，初始含水量轴向等高线变化相对稀疏，故发酵时间对响应值峰值的影响较初始含水量影响大；当初始含水量和发酵时间处于最佳水平时，交互作用，随着发酵时间和初始含水量增加，纤维素降解率逐渐上升，发酵时间轴向等高线变化密集，初始含水量轴向等高线变化相对稀疏，故发酵时间对响应值峰值的影响较初始含水量影响大，发酵时间和初始含水量交互显著。图4～6

图4 接种量和发酵时间对纤维素降解率影响的响应曲面和等高线
Fig.4 Response surface and contour graph of the effects of inoculation amount and fermentation time on degradation rate of cellulose

图5 初始含水量和接种量对纤维素降解率影响的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surface and contour graph of the effects of ratio of substrate to water and inoculation amount on degradation rate of cellulose

图6 初始含水量和发酵时间对纤维素降解率影响的响应曲面和等高线
Fig.6 Response surface and contour graph of the effects of ratio of substrate to water and fermentation time on degradation rate of cellulose

2.4.3 回归模型的验证

通过软件分析，当接种量为15.0%，发酵时间为35.0 d，初始含水量为80.0%时，纤维素降解率有一个预测最大值为36.240%。采用上述最优发酵条件进行试验验证，试验测得纤维素降解率为35.910%，表明预测值与验证实验很接近，说明回归方程能够比较真实的反映各个因素对棉秸秆降解率的影响。

3 讨 论

3.1 饲料资源短缺是限制我国饲料产业健康快速发展的瓶颈，利用我国现有资源，开发新型优质饲料原料是今后我国饲料研究的重点领域[19]。魏敏等[20]测定出新疆奎屯棉花秸秆中粗蛋白6.50%，说明棉秸秆有成为发酵饲料的潜力。而秸秆中纤维素、半纤维素、木质素三者相互缠绕包裹构成了植物细胞壁，它们通过各种化学键连接，成为难降解物质[21]。近年来，国内外致力于研究利用一些物理、化学、生物技术来进行预处理秸秆，从而达到高效利用的目的[22]。微生物降解木质纤维素既是生物质资源利用中的关键问题，也是亟需解决的难点[23]。

3.2 从动物粪便及土壤中分离筛选出产生透明圈的菌株，结合FPA酶活力和CMC酶活力测定。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA 对其中活性最强的菌株进行种属鉴定，为一株枯草芽孢杆菌(Bacillusubtilis)。枯草芽孢杆菌是少量可分泌纤维素胞外酶的细菌之一，是具有木质纤维素降解能力较高的菌株[24]，能够产生包括纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶系，主要通过分泌的纤维素酶的纤维素结合域附着在木质纤维素表面，纤维素受细菌作用易于膨胀而被破坏分解[25]，王尧悦等[26]分离出一株纤维素降解菌经鉴定为枯草芽孢杆菌，发现该菌株对麸皮的粗纤维有很高的降解率。

3.3 单菌发酵分解纤维素产生的还原糖除了部分供微生物自身利用外，大部分累积在培养基中，会反馈阻遏微生物酶类的分泌，影响纤维素的降解[27]。采用混菌发酵可避免产物的阻遏效应，混合菌互利共生，在发酵过程中，添加乳酸菌可提高乳酸、乙酸含量[28]，酵母菌菌体蛋白含量极为丰富，主要被用来利用培养基中的非淀粉多糖作为碳源[29]，使发酵更为彻底[30]。同单菌发酵一样，微生物接种量、发酵时间、水分含量等因素对混菌发酵也有重大影响[31]。研究利用响应面分析法建立棉秸秆纤维素降解率与初始含水量﹑接种量﹑发酵天数三个关键因素之间的二次多项式回归模型，优化了棉秸秆固体发酵纤维素的工艺条件，为棉秸秆饲料化提供了试验及理论依据。

4 结 论

4.1 采用刚果红纤维素琼脂培养基，从粪便及土壤等样品中分离出能够产生透明圈的菌株24株，根据水解圈直径/天数比值直观确定酶相对比活力，其中，菌株 M22 透明圈直径与菌落直径的比例最大值是6.20，测定FPA酶活力和CMC酶活力，该菌株酶活力最大，分别为9.699 U/h、10.435 U/h，经分子鉴定，M22为枯草芽孢杆菌(Bacillusubtilis)，且该菌株符合《饲料添加剂品种目录(2013)》中微生物添加菌的规定，可以应用到饲料添加当中。因此，M22为最适的菌株用作后续实验。

4.2 将菌株M22与产朊假丝酵母(Candidautilis) J1，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同比例设计，实验组③在六组实验中的FPA酶活力和CMC酶活力最高，FPA酶活力为19.420 U/L，CMC酶活力为 20.354 U/L，此实验组的混合比例为J1∶J2∶J3∶M22=1∶2∶1∶1，另外，六组混菌实验的酶活力比添加单菌时候酶活力都要高。最终，选出第实验组③做后续固体发酵优化实验。

4.3 采用3因素3水平的响应面进行分析，研究初始加水量、接种量、发酵时间三个因素交互作用以及各因素对纤维素降解率的影响。得出如下回归方程：Y=18.41+5.47×X1+1.91×X2+4.11×X3+1.16×X1×X2+4.02×X1×X3+0.14X2X3+1.16X12-0.67×X22-0.71X32。方差分析结果，决定系数R2=0.973 8，“Model Prob>F”等于 0.000 1 远小于 0.05，说明模型是显著。在模型各参数中，接种量X1、发酵时间X2、初始含水量X3、二次交互项X1X3对纤维素降解率有极显著(P<0.01)影响。依据系数接种量X1=5.47、发酵时间X2=1.91、初始含水量X3=4.11，可知因素的主效应关系为接种量X1> 发酵时间X2> 初始含水量X3。通过软件Design-Expert.V8.0.6.1软件经手动优化后的回归方程求解，预测最佳棉秸秆固体发酵条件：接种量为15.0 %，发酵时间为35.0 d，初始含水量为80.0 %，在此条件下，纤维素降解率有一个预测最大值为36.24%。采用上述最优发酵条件进行试验验证，试验测得纤维素降解率为35.91%。