外源水杨酸对高温胁迫下牡丹幼苗耐热性的影响

吴 莎，金晓玲,2*，张旻桓，张方静，罗 峰

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南省环境资源植物开发与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)为芍药科芍药属落叶灌木，原产于我国北部及中部，喜光、耐寒、喜凉爽、不耐热，素有“花中之王”的美誉，具有极高的观赏价值，为我国传统名花。此外，牡丹根皮可入药，有清热凉血、活血散淤、抗菌消炎等功效，为我国传统中药[1]。近年来，随着牡丹产业链的发展，牡丹的深加工产品在粮油、保健、美容、生物医药等领域广泛应用，从而使牡丹综合利用价值得以提升，牡丹产业在地方经济中的作用日益凸显，牡丹的栽培面积不断扩大[2]。但南方地区夏季的高温天气，使得牡丹茎叶热害严重，植株提早枯萎，有机物积累有限，地下根系发育不良，最终导致牡丹的产量和品质降低[3-4]。因此，缓解高温对牡丹的伤害是亟待解决的问题。

水杨酸(Salicylic acid, SA)是植物体内普遍存在的一种酚类生长调节剂，是重要的能够激活植物过敏反应和系统获得抗性的内源信号分子；在诱导植物抗病性、抗热性、抗寒性、抗盐性等抗性中发挥着重要的作用[5]。已有研究表明，SA能通过提高叶片渗透调节物质含量和抗氧化酶活性，减少细胞膜脂过氧化作用来有效提高皖贝母[6]、西洋杜鹃[7]的耐热性。薛建平等[8]研究表明，SA可通过保护半夏叶片光合机构来提高其抗高温能力。目前，国内外关于牡丹耐热性方面的研究较少，尤其是有关SA对高温胁迫下牡丹耐热性影响的研究还未见报道。因此，确认SA对牡丹幼苗耐热性的调控效果，找到能有效提高牡丹幼苗耐热性的适宜SA浓度，研究SA对高温胁迫下牡丹幼苗生长和生理的影响，探讨SA提高牡丹幼苗耐热性的机制，为缓解牡丹热害提供理论依据和思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试牡丹品种为凤丹(P.ostiiFengdan)1年生幼苗。凤丹种子采购自湖南省邵阳县郦家坪镇凤丹种植基地。SA为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器：中器PQX-450HPL人工气候箱、756P紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、雷磁DDSJ-308A电导率仪、AR423CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)。

1.2 试验设计

试验于2016年8月至2017年6月于中南林业科技大学内进行。牡丹种子经沙藏生根发芽后，种植于7 cm×10 cm×8 cm(底直径×上口直径×高)规格的营养钵中(1苗/盆)，栽培基质为泥炭∶蛭石∶河砂=3∶1∶1 (V∶V∶V)。幼苗置于湖南省环境资源植物开发与利用工程技术研究中心的温室内常规栽培管理。待幼苗复叶的3个小叶发育成熟后，选取高度和长势一致、健康的植株用于试验。

本研究分为2个试验，试验1确定提高牡丹幼苗耐热性的最适外源SA浓度。方法如下：将试验苗用蒸馏水冲洗3遍后移入人工气候箱中预处理，箱内温度设为25 ℃/20 ℃(昼/夜)；光照强度为3 000 lx，光周期为14 h/10 h；湿度为80%。5 d后对上述植株叶面喷施不同浓度的SA溶液：0.1、10.0、100.0、1 000.0、10 000.0 μmol/L，以喷施蒸馏水作为对照。用于喷施的SA溶液和蒸馏水均用NaOH溶液调节pH值至7。每株喷施约10 mL，每天17：00进行喷施，连续喷施3 d。随后将幼苗置于40 ℃的高温下暗胁迫2 d，湿度设为80%。为减轻高温引起的水分胁迫伤害，高温胁迫期间对幼苗进行补水保湿。每个浓度梯度处理9株苗，3次重复。高温胁迫后测定幼苗的热害指数及叶片电解质渗透率。

试验2是在试验1结果基础上，探讨外源SA提高牡丹幼苗耐热性的作用机制。方法如下：将用于试验的牡丹幼苗预处理后，喷施蒸馏水或100.0 μmol/L SA溶液，方法同试验1。共设置3个试验组：空白对照(CK)，蒸馏水+常温(25 ℃/20 ℃，昼/夜)；单纯高温处理(T1)：蒸馏水+高温(40 ℃/30 ℃，昼/夜)；SA处理 (T2)：SA+高温。每个试验组各处理15株苗，3次重复。3个试验组的光照条件、湿度均同预处理。高温胁迫期间每天对幼苗进行补水保湿。高温胁迫6 d后，将植株移入日光温室中恢复，温室中温度约为25 ℃/18 ℃(昼/夜)，自然光照，常规管理。在高温胁迫的0、2、4、6 d及恢复7 d后(R7)，观测幼苗热害指数，并采取同等大小的功能叶片测定叶绿素含量、电解质渗透率、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量；此外，恢复7 d后测定幼苗的干质量。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 热害指数 热害指数的观测参考张佳平等[9]的方法。热害分级如下。0级：茎叶几乎无热害；1级：少于1/4的茎叶萎蔫或焦尖；2级：1/4～1/2的茎叶焦边；3级：1/2～3/4的茎叶穿孔或枯焦；4级：3/4以上的茎叶枯焦；5级：植株枯萎或枯死。热害指数=Σ(某级别数值×该级别的株数)/(最高级数值×该品种观察总株数)×100%。其数值越小，表明植株耐热性越强。

1.3.2 干质量 将幼苗用蒸馏水快速冲洗干净，吸干表面水分。随后分为地上部分和根系，置于105 ℃烘箱中杀青10 min后转至60 ℃烘干至恒质量，用天平称质量。

1.3.3 生理指标 叶绿素含量采用丙酮乙醇混合液法测定[10]。电解质渗透率采用电导仪法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定；SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定；游离脯氨酸含量采用茚三酮显色法测定[11]。所有指标测定均重复3次。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行差异显著性检验(LSD法)，Origin Pro 9.1软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度SA对牡丹幼苗耐热性的影响

由表1可以看出，0.1～1 000.0 μmol/L的SA处理与蒸馏水处理相比，均能显著降低高温胁迫后牡丹幼苗的热害指数和叶片电解质渗透率，其中以100.0 μmol/L SA处理效果最好。10 000.0 μmol/L SA处理使得牡丹幼苗热害加重。

表1 不同浓度SA对高温胁迫后牡丹幼苗热害指数和叶片电解质渗透率的影响

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 SA对高温胁迫下牡丹幼苗生长的影响

由表2可知，在单纯高温胁迫下，随着时间的延长，牡丹幼苗热害程度加深；恢复7 d后，部分受损程度大的植株死亡，热害指数稍有上升。牡丹幼苗经SA处理后，在胁迫期间植株的热害程度明显低于单纯高温处理，且在胁迫第2天时，植株热害现象不明显；恢复7 d后，胁迫后萎蔫的叶片、植株表现出恢复趋势，热害指数稍有下降。以上结果说明SA处理能缓解高温对牡丹幼苗的伤害。

表2SA对高温胁迫下牡丹幼苗热害指数的影响%

处理处理时间/d0 2 4 6 R7 CK 00000T105.3738.2450.4353.75T200.4910.0030.6729.00

由表3可以看出，牡丹幼苗经单纯高温处理后，茎叶、根、总干质量均显著低于CK，相对CK分别减少了38.10%、89.29%、67.35%。经SA处理后，幼苗的茎叶、根、总干质量显著高于单纯高温处理，分别是单纯高温处理的1.31、5.67、2.19倍。以上结果说明高温胁迫抑制牡丹幼苗干物质的积累，而SA处理能明显缓解高温的抑制作用。

表3 SA对高温胁迫后牡丹幼苗干质量的影响 g

2.3 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片叶绿素含量的影响

由图1可以看出，牡丹幼苗在单纯高温处理后期(≥4 d)，叶片中叶绿素含量显著低于CK，并随着胁迫时间的延长，下降幅度增加。SA处理后，与单纯高温处理相比，在高温胁迫后期(≥4 d)，叶绿素含量下降幅度明显减缓，并随着时间的延长，减缓幅度增加，在胁迫的第4天、第6天时叶绿素含量分别是单纯高温处理的1.15、1.41倍；恢复培养7 d后叶片叶绿素含量稍有回升，显著高于单纯高温处理。以上结果说明，SA能有效缓解高温对牡丹幼苗叶片光合色素合成的抑制作用。

不同小写字母表示不同处理间差异达到显著水平(P<0.05)，下同图1 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片叶绿素含量的影响

2.4 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片电解质渗透率和MDA含量的影响

由图2可以看出，高温胁迫下，SA处理和单纯高温处理的牡丹幼苗叶片电解质渗透率均随胁迫时间延长而增加。但SA处理的牡丹幼苗电解质渗透率在胁迫第2、4、6天时均显著低于单纯高温处理，相对单纯高温处理分别减少了33.07%、31.50%、33.79%，且胁迫第2天时与CK无显著差异。恢复正常条件培养7 d后，SA处理仍显著低于单纯高温处理，但二者均显著高于CK。以上结果说明，SA处理能有效减轻高温胁迫下牡丹幼苗电解质的渗出。

图2 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片电解质渗透率的影响

由图3可以看出，高温胁迫下，SA处理和单纯高温处理的牡丹幼苗叶片MDA含量均随胁迫时间的延长而增加。但SA处理与单纯高温处理相比，MDA含量上升趋势明显减缓，在胁迫第2、4、6天时均显著低于单纯高温处理，相对单纯高温处理分别减少了23.84%、35.23%、32.84%。SA处理在胁迫第2天和第4天时MDA含量与CK无显著差异。恢复7 d后，SA处理的牡丹幼苗MDA含量恢复到正常水平，显著低于单纯高温处理。说明SA有助于缓解高温胁迫下MDA的积累，从而降低高温对细胞膜的过氧化伤害。

图3 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片MDA含量的影响

2.5 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片SOD活性的影响

由图4可以看出，牡丹幼苗在单纯高温处理下，叶片SOD活性变化呈先降后升再降的趋势。在胁迫的第2天、第6天时，叶片SOD活性显著低于对照，在胁迫第4天SOD活性达到最大值，与对照相比未有显著差异。牡丹幼苗经SA处理后，在胁迫的第2天、第6天，叶片SOD活性显著高于单纯高温处理，相对单纯高温处理分别增加了59.02%、118.65%；在胁迫第4天，叶片SOD活性高于单纯高温处理，但差异不显著；恢复7 d后，SA处理的牡丹幼苗SOD活性回升，达到对照水平，显著高于单纯高温处理。说明在高温胁迫下，SA有助于牡丹幼苗维持较高的SOD活性，减少活性氧对细胞的伤害。

图4 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片SOD活性的影响

2.6 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片渗透调节物质的影响

由图5可以看出，高温胁迫过程中，SA处理和单纯高温处理的牡丹幼苗叶片可溶性蛋白含量均随胁迫时间的延长而增加。但SA处理的植株可溶性蛋白含量显著高于单纯高温处理，在第2、4、6天相对单纯高温处理分别增加了33.57%、17.55%、19.17%；正常条件培养7 d后，SA处理和单纯高温处理的牡丹幼苗可溶性蛋白含量有所回落，但SA处理仍显著高于单纯高温处理。

由图6可以看出，高温胁迫过程中，SA处理和单纯高温处理的牡丹幼苗叶片游离脯氨酸含量均随胁迫时间的延长而增加。但SA处理的牡丹幼苗游离脯氨酸含量在胁迫后期(≥4 d)显著高于单纯高温处理，且随时间的延长增加幅度加大；在胁迫第4天、第6天较单纯高温处理分别增加了22.92%、44.96%。恢复7 d后，SA处理的牡丹幼苗游离脯氨酸含量仍显著高于单纯高温处理。说明SA有助于提高高温胁迫下可溶性蛋白含量和游离脯氨酸含量，从而降低细胞渗透势，提高牡丹幼苗耐热性。

图5 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

图6 SA对高温胁迫下牡丹幼苗叶片游离脯氨酸含量的影响

3 结论与讨论

SA提高植物耐热性的有效浓度随试验设计的不同而不同。本研究中，SA浓度在0.1～1 000.0 μmol/L时均有提高牡丹幼苗耐热性的效果，其中以100.0 μmol/L的SA处理效果最好。这与在水稻[12]和葡萄[13]上的研究结果一致。但申惠翡等[7]的研究结果则表明，有效提高西洋杜鹃耐热性的SA浓度相对较低，为0.05 μmol/L。由此推测，有效提高植物耐热性的SA浓度与植物种类及苗龄相关。

幼苗时期是植物生长的关键阶段，幼苗时期的生长情况影响植株后期的生长发育，进而影响产量和品质。外源施用SA能够影响植物的多种生理过程，包括幼苗生长、胁迫响应等[5]。Kumar等[14]在小麦上的研究表明，SA能增加高温胁迫后小麦幼苗的叶鲜质量。Shi等[15]在黄瓜上的研究发现，SA能使锰胁迫后黄瓜幼苗的根系干质量增加。本研究表明，高温胁迫使得牡丹幼苗的生长受到抑制，茎叶、根、总干质量均显著低于正常生长的幼苗。而100.0 μmol/L SA溶液处理能有效缓解高温抑制作用，促进牡丹幼苗干物质的积累。这可能与SA能调节植物叶绿素合成，提高光合效率有关[5]。本试验中对叶绿素的测定结果也证实了这种可能性。

高温胁迫下，植物细胞内活性氧产生和清除的动态平衡遭到破坏，过量产生的活性氧引发膜脂过氧化作用，对植物造成伤害。MDA是膜脂过氧化产物之一，随着膜伤害的发生，膜内的可溶性物质、电解质大量渗漏。前人研究表明，MDA含量和电解质渗透率是鉴定牡丹耐热性的可靠指标[16]。本研究表明，在整个高温胁迫期间，SA处理的植株电解质渗透率和MDA含量均显著低于单纯高温处理。说明SA能减缓牡丹幼苗电解质的渗出，减少膜脂过氧化作用，这与李同根等[6]的研究结果一致。

SOD是抗氧化酶系统的核心酶[17]。一般情况下，SOD活性随高温胁迫时间的延长呈先上升后下降的趋势[13]。徐艳等[16]认为SOD活性可作为鉴定牡丹耐热性的指标。本研究表明，高温胁迫下，牡丹幼苗叶片中SOD活性变化无稳定规律，这与前人对高温胁迫下芍药SOD活性变化趋势的研究结果一致[9]。因此，SOD能否作为评价牡丹耐热性的可靠指标还有待进一步研究。牡丹幼苗经SA处理后，SOD活性呈先上升后下降的趋势，且高于单纯高温处理，说明在高温条件下SA有助于维持较高的SOD活性，这与Gunce等[18]对洋地黄的研究结果一致。

渗透调节是植物抗逆境胁迫的一种重要方式，而可溶性蛋白和游离脯氨酸是重要的渗透调节物质。可溶性蛋白具有保护酶活性的作用，游离脯氨酸具有清除活性氧、防止细胞脱水及解除氨毒害等作用[19]。本研究表明，高温胁迫下SA处理的植株可溶性蛋白含量显著高于单纯高温处理，这与何亚丽等[20]的研究结果一致。这可能与高温下SA促进细胞中热激蛋白的合成有关，而大量热激蛋白富集在膜组分中，有可能担当了阻止膜蛋白变性和防止生物膜热破碎的功能[17]。本试验中对电解质渗透率的测定结果也证实了这种可能性。但关于高温胁迫下植物叶片可溶性蛋白含量的变化趋势仍存在争议[9, 21]。相关研究表明，SA处理能提高高温胁迫下葡萄[22]、桔梗[23]等植物的游离脯氨酸含量。本研究结果表明，高温胁迫后期(≥4 d)SA处理的植株游离脯氨酸含量显著高于单纯高温处理，证实高温胁迫下SA可以促进游离脯氨酸的积累和大量合成，有助于降低细胞渗透势，提高植株耐热性。

综上所述，外源SA通过提高高温胁迫下牡丹幼苗叶片叶绿素含量，降低细胞质膜透性，减少膜脂过氧化作用，提高抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，从而提高牡丹幼苗耐热性，缓解高温伤害，增加幼苗干物质的积累。在今后的研究中还应开展大量田间试验，深入探讨在大田条件下SA对牡丹耐热性提高的效果及相应的施用周期和施用量，从而有助于生产上的应用推广，有利于南方地区牡丹品质和产量的提高。